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.2014年10月15日；34(42):13988-97.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1573-14.2014。

KIS是一种与微管调节因子相关的激酶，可增强AMPA受体的翻译并刺激树突棘重塑

Neus Pedraza公司 1, 劳尔·奥尔蒂斯 1, 阿尔巴·科纳多 1, 阿图尔·卢贝特 2, 马蒂·阿尔迪亚 1, 卡梅·加列戈 三
附属公司

KIS是一种与微管调节器相关的激酶，可增强AMPA受体的翻译并刺激树突状棘重塑

Neus Pedraza公司等。 神经科学. .

摘要

蛋白质合成的局部调节允许神经元快速改变蛋白质组以响应突触信号，这是许多神经疾病中改变的突触可塑性的基本机制。许多突触蛋白的合成受到局部控制，而这种调节大多是通过被称为RNA颗粒的结构进行的。KIS是一种与微管蛋白细胞骨架调节剂stathmin相关的蛋白激酶。此外，KIS存在于RNA颗粒中，并通过神经突中的β-肌动蛋白3'UTR刺激翻译。在这里，我们探讨了KIS对小鼠海马突触可塑性作用的生理和分子机制。KIS下调会损害脊柱发育，改变肌动蛋白动力学，并降低突触后反应性。KIS的缺失导致PSD-95、突触后支架蛋白以及AMPAR亚单位GluR1和GluR2的蛋白水平显著降低，且呈CPEB3依赖性。KIS在脊椎成熟过程中发挥作用，能够抑制CPEB3过度表达导致的脊椎发育缺陷。此外，KIS通过直接或间接机制，在mRNA翻译和多聚腺苷化水平上抵消CPEB3对GluR2 3'UTR的抑制活性。我们的研究揭示了调节树突状棘形态发生和功能性突触成熟的机制，并认为KIS是调节记忆形成中棘细胞骨架和突触后活动的一个环节。

关键词：AMPA受体；KIS；海马；地方翻译；脊柱重塑；突触可塑性。

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数字

图1。
图1。
KIS下调影响脊柱形态。用表达GFP和对照（shCtrl）或KIS（shKIS）shRNAs的慢病毒载体在7 DIV处转染海马神经元。神经元固定在18 DIV。通过SpineJ软件分析GFP阳性神经元来评估脊柱数量和形态的变化（见材料和方法）。A类，表达shCtrl或shKIS的神经元的两个典型共焦图像。比例尺，10μm。神经炎细节显示在底部，SpineJ检测到的突起用绿色标记。比例尺，5μm。B类，Sholl分析每种情况下10个神经元的树突复杂性。图中显示了树枝晶与同心圆的交点数量及其半径。50至100μm之间的平均值用虚线表示第页成对的值t吨测试显示。C类，树突棘的面积图(n个>400）来自5个shKIS转染神经元和5个shCtrl神经元。天，树突棘的长度(n个>400）相对于脊柱区域。蘑菇状树突棘的这一比率低于细丝状突起。显示了平均值的平均值（粗水平线）和置信限（α=0.05，细垂直线）。通过ANOVA分析shCtrl和shKIS处理的神经元之间的差异，并通过事后（post-hoc）舍夫方法。获得第页值在每个面板中说明(C类,天).
图2。
图2。
正确的肌动蛋白动力学需要KIS。如图1所示，将神经元培养物固定在18 DIV，并用指骨苷染色以检测β-肌动蛋白聚合物。表达shCtrl的神经元的两个典型共焦图像(A类)或shKIS(B类). 比例尺，20μm（绿色为GFP，红色为卵磷脂）。神经炎的详细信息显示在底部。比例尺，10μm。C类用SpineJ分析了5个shKIS转染神经元和5个shCtrl神经元的脊髓，以及面积为0.5±0.25μm的神经元2已选定。脊椎中的磷脂水平(n个=150）绘制为从shCtrl神经元获得的平均值的相对值。显示了每个神经元的平均值（粗水平线）和平均值的置信限（α=0.05，细垂直线）。通过ANOVA分析shCtrl和shKIS处理的神经元之间的差异，并通过事后（post-hoc）舍夫方法。获得的第页显示值。
图3。
图3。
KIS击倒降低mEPSC振幅。在低密度下接种海马神经元，并在7 DIV时用表达GFP和对照（shCtrl）或KIS（shKIS）shRNAs的慢病毒载体感染海马神经元。电生理实验在17-21 DIV进行。A类，显示了来自shCtrl神经元（灰色）和shKIS神经元（红色）的两个代表性全细胞电流轨迹。B类，从shCtrl（5个神经元>5700事件）和shKIS感染神经元（7个神经元>7300事件）获得的mini-EPSC振幅的累积概率直方图。绘制了平均值的插入值、平均值和置信限（α=0.05）。C类，神经元最小-EPSC间隔的累积概率直方图，如B类插图中绘制了平均值的平均值和置信限（α=0.05）第页成对的值t吨测试如所示B类和C类.
图4。
图4。
KIS下调降低GluR1、GluR2和PSD-95蛋白水平，降低翻译率。用表达GFP和KIS（shKIS）shRNA的载体在7 DIV处转染海马神经元，有或没有人KIS表达质粒，并在18 DIV处通过免疫荧光分析(A–C)或在3-4 DIV感染表达对照（shCtrl）或KIS（shKIS）shRNAs的慢病毒载体，并培养至13-14 DIV(D–F型).A类，用于量化转染细胞（GFP-shKIS，绿色）和未转染细胞中GluR1、GluR2和PSD-95蛋白（红色）的代表性图像作为参考。比例尺，20μm。B类，未转染体的荧光水平(n个=5个/场），shKIS转染(n个=10），并对shKIS+人KIS共转染细胞进行量化，绘制平均值和置信限（α=0.05）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。C类实验显示的细胞代表性神经突（GFP-shKIS，绿色）的GluR1、GluR2和PSD-95免疫荧光图像（红色）A类.比例尺，5μm。天,E类BONCAT分析。海马神经元与蛋氨酸类似物AHA（叠氮高丙氨酸）孵育4h，与生物素-炔烃偶联后，用亲和素珠亲和纯化细胞提取物。天通过免疫印迹分析总提取物，以评估KIS（顶部）和生物素AHA标记蛋白（底部）的水平。E类通过免疫印迹法在细胞提取物（总量）和亲和素结合组分（新生）中检测GluR1、GluR2、PSD-95和VDAC（作为对照）。F类，海马神经元表面用生物素标记，细胞提取物（总量）和亲和素结合组分（表面）通过免疫印迹分析，以量化GluR1和GluR2的蛋白质水平。平均值(n个=8），并绘制平均值的置信限（α=0.05）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。
图5。
图5。
KIS通过CPEB3调节GluR1和GluR2的翻译。A类,体内KIS和CPEB蛋白之间的相互作用。将表达CPEB蛋白的载体与表达FLAG或FLAG-KIS的载体联合转染HEK293T细胞。用αFLAG珠、CPEBs和输入的FLAG-KIS水平进行免疫沉淀，并用Western blot分析免疫沉淀（IP）样品。B类，海马神经元在3-4 DIV感染表达对照（shCtrl）、KIS（shKIS）或CPEB3（shCPEB3）shRNAs的慢病毒载体，并培养至13-14 DIV。显示了全细胞提取物的免疫印迹，以量化KIS、CPEB3、GluR1、GluR2和α-微管蛋白。C类，蛋白质水平与α-微管蛋白相关，平均值(n个=6），并绘制平均值的置信限（α=0.05）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。天用表达GFP和KIS、CPEB3或KIS+CPEB3的质粒载体转染海马神经元，24小时后成像。显示了具有代表性的神经炎。E类，量化用空载体转染的细胞中每10μm（每神经元10 20μm轨迹）突起的数量(n个=21）作为对照，或表达KIS的质粒(n个=27），CPEB3(n个=15），或KIS+CPEB3(n个= 31). 还显示了平均值的平均值（粗水平线）和置信限（α=0.05，细垂直线）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。
图6。
图6。
KIS促进CPEB3从GluR2 3′UTR中分离并调节其聚腺苷酸化。A类，GluR2 3′UTR荧光素酶报告子分析。将融合于GluR2 3′UTR的Gaussia荧光素酶ORF与表达KIS、CPEB3或CPEB3+KIS的质粒载体联合转染HEK293T细胞。值是相对于从空向量（Ctrl）中获得的值进行的。平均值(n个=6）和平均值的置信极限（α=0.05）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。B类，RNase处理对KIS与CPEB3相关性的影响。在免疫沉淀（IP）之前，将表达CPEB3和FLAG或FLAG-KIS的HEK293T细胞的总提取物（输入）与（+）或（-）RNase孵育，并通过免疫印迹分析相应的αFLAG免疫沉淀（FLAG-IP），以检测CPEB3及FLAG-KIS蛋白。C类RNA免疫沉淀和定量PCR。将融合于GluR2 3′UTR的萤火虫荧光素酶ORF与表达FLAG、FLAG-CPEB3或FLAG-CPEB3+KIS的载体联合转染HEK293T细胞。用FLAG-IgG免疫沉淀细胞裂解物，并用RT-qPCR逆转录和定量沉淀的mRNA。Luc-GluR2 3′UTR mRNA水平与GADPH mRNA相关。绘制了三个独立实验的平均值和平均值的置信限（α=0.05）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。天，GluR2 3′UTR的聚腺苷酸化分析。HEK293T细胞的细胞提取物C类分别扩增poly（A）（top）和total（bottom）Luc-GluR2 3′UTR mRNA，并用琼脂糖电泳分离得到产物。E类，细胞提取物，如天免疫印迹法检测CPEB3和KIS蛋白。F类，通过样品密度分析获得的聚腺苷酸化曲线，如天.G公司，从中的剖面定量相对聚腺苷化水平F类作为poly（A）/nonpoly（A）比率。平均值(n个表示平均值的置信限（α=0.05）。获得第页相关成对值t吨显示了测试。
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中的注释

  • KIS：突触可塑性缺失的分子环节？
    Brudvig J，Cain J。 Brudvig J等人。 神经科学杂志。2015年2月18日；35(7):2839-41. doi:10.1523/JNEUROSCI.5082-14.2015。 神经科学杂志。2015 PMID：25698723 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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