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.2014年9月18日；5（9）：e1424。
doi:10.1038/cddis.2014.369。

MAP4磷酸化依赖性线粒体易位是缺氧诱导心肌细胞凋亡的早期步骤

J Hu（胡锦涛） 1, Z楚 2, J韩 三, Q张 2, D张 2, Y Dang（Y当当） 2, J Ren先生 4, H C Chan公司 5, J张 2, Y Huang（黄） 2
附属机构

MAP4磷酸化依赖性线粒体易位是缺氧诱导心肌细胞凋亡的早期步骤

J Hu（胡锦涛）等。 细胞死亡病. .

摘要

缺氧或缺血细胞凋亡通常与线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放密切相关；然而，调节mPTP和线粒体依赖性凋亡的分子机制尚不清楚。新的证据表明，线粒体内外关键蛋白的运动在细胞凋亡中起着关键的调节作用。在此，我们报道了新生儿心肌细胞缺氧处理后磷酸化后，微管相关蛋白4（MAP4）意外地从细胞质转移到线粒体。当靶向线粒体时，发现MAP4可导致mPTP开放并诱导细胞凋亡。MAP4磷酸化的遗传抑制可以逆转MAP4的线粒体积累和促凋亡功能。MAP4（Ala）突变体模拟去磷酸化形式，抑制线粒体移位和凋亡。我们的数据揭示了MAP4在心脏凋亡中的新作用，并提出了针对MAP4线粒体易位的潜在治疗策略，以对抗凋亡性心脏病。

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数字

图1
图1
线粒体中MAP4的鉴定和定位(一和b)典型共焦免疫荧光图像(一)或定量分析(b)缺氧应激下MAP4与线粒体的共定位增加。(c（c）和d日)典型共焦免疫荧光图像(c（c）)或定量分析(d日)低氧应激下MAP4与微管共定位减少。黄色反映了MAP4-GFP（绿色）与线粒体跟踪器（红色）或微管（红色）的重叠。比例尺，20 μm.为了进行定量分析，随机选择并计算了10个细胞(n个=3). 具有代表性的免疫印迹显示MAP4的亚细胞定位及相应标记(e（电子）). 膜，质膜；线粒体；内质网；核，细胞核；细胞，胞浆；过氧化物酶体；TME，线粒体总提取物；OM，外膜；IMS，膜间空间分数；IM，内膜；MA，矩阵分数。所有数据均为平均值±S。电子显微镜*P（P）<0.01与方差分析法控制常氧事后（post-hoc）分析
图2
图2
低氧胁迫下MAP4磷酸化后迅速移位至线粒体。(一)低氧诱导培养心肌细胞中S696、S768和S787处MAP4的磷酸化，而总MAP4没有变化。(b)缺氧处理后，培养心肌细胞线粒体中的总MAP4和p-MAP4显著增加，同时总MAP4显著降低，其余部分中的p-MAP4也有所降低。(c（c）)抗p-MAP4（S696）和抗p-MAP 4（S787）多克隆抗体的制备和验证。Np-pep，非肽类；p-pep、phos-肽；Np-Ab，非宿主抗体；p-Ab，phos-抗体。(d日)确认腺病毒在心肌细胞中以可比水平转染。western blotting分析转染MAP4、MAP4（Glu）或MAP4（Ala）腺病毒后心肌细胞的总细胞提取物。(e（电子）和（f）)典型共焦免疫荧光染色(e（电子）)和定量分析(（f）)与野生型对照组（MAP4-GFP）相比，MAP4（Glu）增加了MAP4与线粒体的共定位，而MAP4（Ala）突变体降低了MAP4的共定位。心肌细胞被双重标记为线粒体（MitoTracker Red CM-H2XRos）和突变MAP4（Cy3结合抗HA抗体）或MAP4-GFP。棒材，20 μm.为了进行定量分析，随机选择并计算了10个细胞；n个=3份，一式三份。(克)western blots证实MAP4突变体的差异定位。MAP4（Glu）：MAP4（S696G、S678G、S787G），MAP4（Ala）：MAP四（S696A、S678A、S787 A）。所有数据均为平均值±S。电子显微镜*P（P）<0.01与MAP4控件
图3
图3
p-MAP4的线粒体易位是缺氧心肌细胞凋亡所需的早期步骤。(一)膜联蛋白V-Cy3/SYTOX绿色染料染色检测到凋亡或坏死的心肌细胞死亡。凋亡细胞呈红色（早期凋亡）或黄色（晚期凋亡）；坏死细胞呈绿色。酒吧，100 μ米(b和c（c）)凋亡的数据总结(b)或坏死(c（c）)Annexin V-Cy3/SYTOX绿色染色检测细胞。(d日和e（电子）)TUNEL染色评价心肌细胞凋亡。TUNEL染色显示凋亡的典型图像(d日)和定量分析(e（电子）)正常或缺氧心肌细胞中MAP4（Glu）或MAP4（Ala）过度表达或不过度表达。酒吧，100 μ米*P（P）<0.01与常氧CMV-null；#P（P）<0.01与低氧CMV-null
图4
图4
p-MAP4易位对心肌细胞线粒体凋亡变化的影响。(一个)western blots检测线粒体Cyt-C释放。(B)Caspase-9荧光分析试剂盒检测到的Caspase-8活性。(C和D类)钙黄绿素荧光法测定mPTP开放(C)或通过四甲基罗丹明乙酯（TMRE）测定线粒体膜电位(D类). *P（P）<0.01与常氧CMV-null；#P（P）<0.01与缺氧CMV无效。(E类)ADP/ATP比值测定试剂盒检测到ATP/ADP。(F类)MAP4（Glu）可诱导mPTP开放，如钙黄绿素荧光降低所示，而CsA（5 μM） ●●●●。(G公司)典型的电子显微镜图像显示缺氧或MAP4（Glu）诱导的线粒体典型凋亡（b、d和e的黑色圆圈区域）和肿胀（d的白色方形区域扩大）或收缩（d的黑色箭头和b和e的白色方形面积扩大）。a为正常对照，MAP4（Ala）保护细胞免受凋亡（c，f）*P（P）<0.01与CMV-零位控制；#P（P）< 0.01与MAP4（Glu）过表达载体组。MAP4（Glu）：MAP4（S696G、S678G、S787G），MAP4（Ala）：MAP四（S696A、S678A、S787 A）。共随机选择20张图像，并对每组进行分析。所有数据均为平均值±S。一式三份的六个独立实验的E.M
图5
图5
线粒体p-MAP4独立于微管组装而导致细胞凋亡。(一个)代表性免疫染色结果显示，与正常细胞（a，f）相比，转染MKK6（Glu）（e，j）的心肌细胞中有更多的微管网络被分解。插入物中的方框区域以较高的放大率显示，以说明细节。野生型MAP4（b，g）或MAP4（Ala）（d，i）导致微管凝聚，而MAP4（Glu）（c，h）对微管结构没有影响。棒材，25 μ米(B和C)有代表性的吸光结果(B)和定量分析(C)显示心肌细胞中聚合或游离微管蛋白不受MAP4（Glu）的影响，但受野生型MAP4、MAP4（Ala）或MKK6（Glu。其中，选择线粒体组分中的VDAC作为聚合微管蛋白的对照，选择胞质组分中GAPDH作为游离微管蛋白内部对照。(D类)通过IP测定野生型MAP4、MAP4（Glu）、MAP4的过表达或MKK6的过表达细胞中MAP4与微管蛋白的结合。数据为平均值±S。一式三份的六个独立实验的E.M*P（P）<0.01与聚合微管蛋白调控；#P（P）<0.01与方差分析法控制游离微管蛋白事后（post-hoc）测验
图6
图6
示意图显示缺氧应激下p-MAP4易位介导的线粒体心肌细胞凋亡。MAP4主要与细胞溶质微管结合，在微管动力学中起重要作用。当缺氧激活内源性凋亡途径时，MAP4一旦磷酸化就从微管蛋白中分离出来，从而导致微管不稳定。磷酸-MAP4（p-MAP4）转运到线粒体并导致mPTP开放和凋亡
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