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.2014年6月24日；9（6）：e100127。
doi:10.1371/journal.pone.0100127。 2014年电子收集。

受体相互作用蛋白激酶3促进抗凋亡食管鳞癌细胞中顺铂触发的坏死

杨旭 1, 林正伟 1, 赵楠（Nan Zhao） 1, 周兰平 1, 刘芳（音） 1, 兹比格尼乌·奇查茨 2, 林章（Lin Zhang） 三, 詹启敏（Qimin Zhan） 1, 赵晓航 4
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受体相互作用蛋白激酶3促进抗凋亡食管鳞癌细胞中顺铂触发的坏死

杨旭等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

以顺铂为基础的化疗目前是局部晚期食管癌的标准治疗方法。顺铂已被证明可诱导癌细胞凋亡和坏死，但诱导程序性坏死的机制尚不清楚。在这项研究中，我们提供了证据表明，顺铂在抗凋亡食管癌细胞中诱导坏死细胞死亡。这种细胞死亡依赖于RIPK3和通过自分泌TNFα形成坏死体。更重要的是，我们证明RIPK3对于顺铂诱导的食管癌细胞杀伤是必要的，因为坏死抑制素抑制RIPK1活性或敲除RIPK3可显著减轻坏死并导致顺铂抵抗。此外，微阵列分析证实了食管癌细胞对顺铂的抗凋亡分子表达模式。综上所述，我们的数据表明，当食管癌细胞的凋亡途径受到抑制或缺失时，RIPK3和TNFα的自分泌通过启动坏死而促进顺铂敏感性。这些数据为顺铂诱导坏死的分子机制提供了新的见解，并表明RIPK3是预测凋亡抵抗和晚期食管癌顺铂敏感性的潜在标记物。

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数字

图1
图1。顺铂诱导ESCC细胞死亡。
（A） 对9个食管癌细胞株的总细胞蛋白提取物进行SMAC的western blot分析；SMAC-KD-D10显示稳定击倒SMAC。SMAC蛋白水平被量化，归一化为β-肌动蛋白，并显示在下部条形图中。（B） 采用膜联蛋白V/碘化丙啶染色和流式细胞术观察顺铂作用24 h后KYSE140、EC0156和SMAC-KD-D10细胞的凋亡情况。（C） DAPI核染色后观察细胞核。EC0156细胞在顺铂作用24小时后出现更多的凋亡细胞核，但在处理过的KYSE140细胞中几乎没有凋亡细胞核。（D） 顺铂处理24小时和48小时后KYSE140、EC0156和SMAC-KD-D10细胞的剂量依赖性曲线。
图2
图2。顺铂触发KYSE140细胞的程序性坏死。
（A） 采用Mito Tracker Red CMXRos染色法测定KYSE140和EC0156细胞的线粒体膜电位，并在顺铂治疗24 h后用流式细胞仪进行分析。细胞用H2DCF-DA染色20分钟，然后用流式细胞仪测定ROS水平。所有实验至少进行了三次。（D） KYSE140和EC0156用10µM顺铂处理12或24小时。通过蛋白质印迹评估胱天蛋白酶激活。箭头表示半胱氨酸蛋白酶裂解碎片。（E） 对8个食管癌细胞系的总细胞蛋白提取物进行RIPK3的western blot分析。β-肌动蛋白作为负荷控制。（F） 顺铂治疗后KYSE140细胞的透射电镜观察。对照细胞的细胞膜完整，顺铂处理的细胞膜塌陷和细胞器肿胀。
图3
图3。顺铂通过在KYSE140细胞中自分泌TNFα触发坏死体的组装。
（A） 用10µM顺铂处理KYSE140细胞6、12或24小时，通过RT-PCR测定RIPK3 mRNA水平。将相对密度与GAPDH对照进行比较。（B） 通过western blot分析检测RIPK3蛋白的表达。RIPK3蛋白水平被量化并归一化为β-肌动蛋白。（C） 顺铂促进TNFα的转录。在指定的时间点用10µM顺铂处理KYSE140细胞，并用RT-PCR分析TNFαmRNA水平。将相对密度与GAPDH对照进行比较。（D） 顺铂促进肿瘤坏死因子α的自分泌。用顺铂处理KYSE140细胞指定的时间点，并用ELISA测定上清液中TNFα分泌水平。（E） RIPK3与RIPK1和MLKL相互作用。顺铂治疗12和24小时后，使用抗RIPK1或抗MLKL抗体免疫沉淀RIPK1和MLKL。western blot分析检测RIPK1、RIPK3和MLKL。（F） 用10µM顺铂处理KYSE140细胞6或12 h。从处理过的细胞中分离出线粒体和细胞溶质部分，并用western blotting分析指示的蛋白质。AIF被用作线粒体分数和负荷的对照。
图4
图4。RIPK3是顺铂诱导的坏死所必需的。
（A） 使用western blot分析测定RIPK3敲除的效果，β-肌动蛋白作为负荷对照。（B） 用10µM顺铂处理RIPK3-KD-F2克隆和亲代细胞24小时。用MTT法评估细胞活力。数据表示与亲代细胞相比，细胞死亡的平均百分比±SD。（C） 在RIPK3-KD细胞中顺铂处理6小时后，使用集落形成测定法测定细胞的长期生存能力。（D） 用10µM顺铂治疗6、12或24 h后，对亲代和RIPK3-KD-F2细胞中的Bcl-2和survivin进行Western blot分析。以β-肌动蛋白作为负荷对照。（E） 使用20µM Nec-1或DMSO预培养KYSE140细胞1小时，然后使用10µM顺铂处理24小时。使用MTT分析测定细胞活力，并以DMSO对照的百分比表示。（F） 用20µM Nec-1或DMSO预培养KYSE140和EC0156细胞1小时，然后用10µM顺铂处理24小时，然后再用新鲜培养基替换培养基。用结晶紫染色法鉴定菌落并在显微镜下计数。（G） 通过western blotting分析RIPK1敲除的影响，β-肌动蛋白作为负荷对照。（H） 用指示浓度的顺铂处理带有RIPK1 siRNA的KYSE140细胞24小时。数据表示与对照细胞相比，细胞死亡的平均百分比±SEM。
图5
图5。顺铂治疗后微阵列数据的聚类显示。
（A） 顺铂治疗6小时后，使用RNA分离试剂盒提取RNA用于微阵列分析。使用DAVID功能注释聚类工具，根据上调基因的生物学过程对上调基因进行功能分类。（B） 通过实时RT-PCR测定10µM顺铂作用6 h后KYSE140细胞中细胞死亡相关基因的mRNA水平。数据表示相对mRNA水平与未处理细胞的平均±SEM。（C） 用western blotting分析10µM顺铂处理指定时间点后KYSE140细胞中FOS、RIPK3、MLKL、细胞色素C、survivin和caspase-9的蛋白水平。（D） 通过实时PCR测定10µM顺铂作用6 h后KYSE140和EC0156细胞中细胞死亡相关基因的mRNA水平。**，P（P）<0.05; ***,P（P）<0.01.
图6
图6。RIPK3过度表达抑制肿瘤生长。
（A） 用蛋白质印迹分析在稳定的KYSE410克隆中分析RIPK3过表达。（B） 用10µM或20µM顺铂处理RIPK3过表达克隆和亲代细胞24小时。用流式细胞术评估细胞活力。数据表示活细胞与亲代细胞相比的平均百分比±SD。（C） 用10µM顺铂结合半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂z-LEHD（5µM）或z-DEVD（5μM）处理KYSE410-vec和RIPK3-D8克隆细胞24小时。用MTT法测定细胞活力。（D） 治疗后每隔2至3天测量肿瘤体积。与对照组相比，RIPK3-D8克隆细胞降低了异种移植瘤的生长(P（P）<0.001). （E） 与亲代KYSE410细胞相比，RIPK3过度表达细胞中的肿瘤生长减少。将亲代和RIPK3-D8细胞悬浮在0.1 ml PBS中，并注射到裸鼠体内以建立异种移植瘤。底部面板显示H&E染色和异种移植组织免疫染色测定的RIPK3表达。i、 对照异种移植组织的H&E染色；ii、RIPK3-D8异种移植组织的H&E染色；iii、对照异种移植组织免疫染色（×100）；iv，异种移植组织中RIPK3过度表达的免疫染色（×100）。RIPK3主要定位于食管癌上皮细胞的细胞质中。
图7
图7。顺铂诱导坏死的信号传导途径的说明。
顺铂诱导的坏死需要通过自分泌TNFα来先天性抑制凋亡途径和坏死体组装，包括RIPK1、RIPK3和MLKL。蓝色椭圆代表下调的蛋白质，橙色椭圆代表上调的蛋白质。
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参考文献

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出版物类型

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赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金（No.81071811，91029725，81321091，81372591，81372385）、国家高技术研究计划（No.2012AA020206，2012AA02A503）和国家重点基础研究项目（No.2011CB910703）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。