Ciliopathy proteins regulate paracrine signaling by modulating proteasomal degradation of mediators

doi:10.1172/JCI71898

.2014年5月；124（5）：2059-70。

doi:10.11172/JCI71898。 Epub 2014年4月1日。

睫状体病变蛋白通过调节介体的蛋白酶体降解来调节旁分泌信号

杨凡·P·刘, 蔡怡纯, 曼纽拉·莫利奥, Edwin C哦, 卡门·C·莱奇, 菲洛梅娜·马萨, 李炳勋, 大卫·S·帕克, 丹尼尔·芬利, 诺兰·扎格鲁尔, 布鲁内拉·弗兰科, 尼古拉斯·卡萨尼斯

PMID： 24691443
预防性维修识别码：项目经理4001542
内政部： 10.1172/JCI71898

睫状体病变蛋白通过调节介体的蛋白酶体降解来调节旁分泌信号

杨凡·P·刘等。临床研究杂志. 2014年5月.

.2014年5月；124(5):2059-70.

doi:10.1172/JCI71898。 Epub 2014年4月1日。

作者

PMID： 24691443
预防性维修识别码：项目经理4001542
内政部： 2017年10月17日/JCI71898

摘要

纤毛是旁分泌信号传导的关键介质；然而，导致纤毛病变的蛋白质是否通过共同的机制在多个旁分泌途径上聚合尚不清楚。这里，我们表明纤毛病相关蛋白Bardet-Biedl综合征4（BBS4）或口腔面部数字综合征1（OFD1）的缺失导致通常以蛋白酶体降解为目标的信号介质的积累。在WT细胞中，几个BBS蛋白和OFD1与蛋白酶体亚单位相互作用，BBS4或OFD1的丢失导致中心体蛋白酶体中多个亚单位的耗竭。此外，蛋白酶体调节成分的过度表达或蛋白酶体激活剂萝卜硫烷（SFN）和甲戊内酯（MVA）的治疗改善了BBS1、BBS4和OFD1缺失细胞、变形斑马鱼胚胎和OFD1缺乏小鼠诱导神经元的信号缺陷。最后，我们测试了以下假设：在没有纤毛病蛋白的情况下，其他未知与纤毛病相关的蛋白酶体依赖性途径是有缺陷的。我们发现BBS1、BBS4或OFD1的丢失导致NF-κB活性降低，并伴随IκBβ的积累，这些缺陷通过SFN治疗得到改善。综上所述，我们的数据表明，基底体蛋白酶体调节控制旁分泌信号通路，并表明增强蛋白酶体功能可能有益于纤毛病患者。

PubMed免责声明

数字

**图1。GFP在*背景4^–/–*老鼠。**
(A类和B类)用抗GFP免疫印迹法检查肾脏（P80）、肝脏（P144）、几个大脑成分（P80(B类)第页，共页*Ub（英国）^G76伏-Gfp背景4^–/–*老鼠，带*Ub（英国）^G76伏-全球粮食计划署*WT室友用作对照。每个面板中的大脑样本在相同的凝胶上进行，但不连续。(C类)P23和P126视网膜切片的免疫组织化学*Ub（英国）^G76伏-全球粮食计划署*转基因小鼠。观察到视网膜进行性变性和光感受器（OS、IS和ONL）中GFP的积累*背景4^–/–*老鼠，但不在WT的窝友中。OS用抗s-视蛋白免疫标记；用DAPI染色法标记ONL和INL。视网膜色素上皮；OS，光感受器的外段；IS，内段；ONL，外核层；OPL，外丛状层；INL，内核层；IPL，内丛状层；GCL，神经节细胞层。放大后的图像用白色方框分隔，显示OS和IS.HP，海马体；CX，皮层；CB，小脑。白色方框分隔放大的图像，显示OS和IS。比例尺：图像和插页中的25μm。在每个斑点附近绘制显示平均值标准误差的条形图**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01.

**图2。纤毛病蛋白耗竭后Shh和Notch信号介质的积累。**
(A类)T8-衍生的GLI2FL、GLI3FL和SUFU的积累以及GLI3R的减少*办公室1^击倒对手*神经元。(B类)在E10.5，检测到GLI2FL、GLI3FL和SUFU在来自*办公室1*^Δ4-5/年老鼠，带*办公室1^+/年*用作对照的老鼠。(C类)抑制*英国广播公司4*与中的级别相比，增加了标记的NICD级别*p超级*控制。(D类)抑制*英国广播公司4*导致GFP标记的JAG1增加2倍。每个面板中的样本B类和C类在同一凝胶上运行，但不连续。在每个斑点附近绘制显示SEM的条形图**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01.

**图3。纤毛病蛋白丢失导致蛋白酶体降解中断。**
(A类)蛋白酶体激动剂SFN治疗改善T8-衍生的GLI3FL、GLI2FL和SUFU的积累*办公室1^击倒对手*神经元。(B类)抑制*英国广播公司4*在HEK-293-FT细胞中，β-catenin蛋白水平增加了1.57倍，可以被SFN挽救。(C类)的过度表达*英国广播公司4*降低NICD水平。MG132治疗恢复了Flag-NICD水平。每个面板中的样本C类在同一凝胶上运行，但不连续。在每个斑点附近绘制显示SEM的条形图**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01; ****P（P）*< 0.001.

**图4。睫状体病蛋白与蛋白酶体成分相互作用并调节蛋白酶体组成。**
(A类)免疫印迹显示内源性OFD1和标记的RPT6与内源性BBS4和GFP标记的RPN10之间的相互作用。从C57BL/6小鼠睾丸分离的蛋白裂解物中检测到BBS1和RPN10之间存在内源性相互作用。(B类)免疫印迹显示，抑制HEK-293细胞中的OFD1可降低纯化26S蛋白酶体中的RPT2蛋白水平。绘制了蛋白酶体RPT2蛋白水平的密度测量图(n个=3），RPT2总丰度无显著差异。考马斯蓝染色作为负荷控制，并测量26S蛋白酶体纯化过程的效率。(C类)HEK-293细胞中OFD1的抑制导致OFD1缺失细胞中核周RPN10水平（归一化为细胞质RPN10）的降低。比例尺：10μm。(D类)转染HEK-293-FT细胞*p超级*控制和*pSuperOFD1（超级OFD1）*进行蔗糖梯度离心。然后用抗γ-微管蛋白和蛋白酶体亚单位的抗体通过免疫印迹法分析组分（13个组分中的6–12个组分）。在对照细胞中，富含所有蛋白酶体亚单位的组分与富含γ-微管蛋白的组分（组分8）部分重叠，当OFD1耗尽时，RPN10、RPN13、RPT2、，和RPT6显著移动，导致γ-微管蛋白富集组分和19S亚基富集组分之间的重叠减少***P（P）*< 0.01; ****P（P）*< 0.001.

**图5。蛋白酶体的激活改善论坛和*第1页*变形斑马鱼胚胎。**
(A类)人的共射*RPN10型*,*RPN13型*、和*RPT6型*mRNA导入*英国广播公司4*和*第1页*变形斑马鱼胚胎在9±1 ss时挽救体节性和CE缺陷，并异位表达*her4（her4）*在4.5 dpf时（下一行的箭头）。根据车身间隙角（上排箭头）对CE缺陷进行评分。的表达式*her4（her4）*通过全山RNA原位杂交检测。(B类,C类、和D类)SFN联合注射挽救了体液性和CE缺陷以及异位*her4（her4）*中的表达式*论坛4*(B类),*英国广播公司1*(C类)、和*第1页*(D类)变形斑马鱼胚胎，而单注射SFN并没有产生任何明显的表型(B类). 如顶行所示（背视图），体节（杆）在*论坛4*(B类),*英国广播公司1*(C类)、和*第1页*(D类)在与SFN共同注射的变形斑马鱼胚胎中，变形体和被缩短。在第二行（侧视图）中，体格间隙角（箭头）在变形体中较大，在SFN的存在下减小。虚线框在第三行中分隔放大的图像，显示SFN处理对体节边界定义缺陷的影响。体节边界清晰、CE缺陷的胚胎百分比和样本量(n个)在每种情况的图像下方注明。比例尺：100μm。

**图6。BBS4-、BBS1-和OFD1缺失细胞中的NF-κB信号传导缺陷，以及*Ofd1标准*条件敲除小鼠。**
(A类–C类)抑制*英国广播公司4*(A类),*英国广播公司1*(B类)，或*OFD1公司*(C类)在HEK-293-FT细胞中，3X-κB-L荧光素酶报告子对12小时TNF-α治疗的反应性降低。用SFN孵育6小时，部分恢复了对TNF-α刺激的敏感性(n个= 3). (D类和E类)GFP标记的IκBβ蛋白水平在缺乏*英国广播公司4*,*英国广播公司1*(D类)，或*OFD1公司*(E类)与对照组相比。SFN孵育挽救了IκBβ-GFP的积累。(F类)肾组织中IκBβ的蛋白水平*办公室1^{飞行/飞行}CAG-核心工程师^TM公司*(*办公室1^{飞行/飞行}CKO公司*)P8（囊前期）和P20（囊性期）小鼠的肾组织中的水平高于WT同窝小鼠。(**G公司**)mRNA水平我κB类β (*Nfkbib（牛顿磅）*)肾组织中*办公室1^{飞行/飞行}CKO公司*与第8天野生动物的mRNA水平相比*办公室1^{飞行/飞行}CAG-核心工程师^TM公司*和P20处的控制(n个= 3). 在每个斑点附近绘制显示SEM的条形图**P（P）*< 0.05; ***P（P）*< 0.01; ****P（P）*< 0.001.

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