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.2014年5月；10(5):785-802.
doi:10.4161/auto.28072。 Epub 2014年2月25日。

AMPK-PPARGC1A通路是通过激活自噬进行抗菌宿主防御所必需的

Chul-Su Yang公司 1, Jwa-Jin金 1, 李慧美 1, Hyo Sun Jin先生 1, 李尚禧 2, 济湖公园 三, Soung Jung Kim（宋正金） 4, 金曼·金 5, Yong-Mahn Han先生 6, 李明石 7, 吉良宽 三, Minho Shong公司 4, Eun-Kyeong Jo公司 1
附属公司

AMPK-PPARGC1A通路是通过激活自噬进行抗菌宿主防御所必需的

Chul-Su Yang公司等。 自噬. 2014年5月.

摘要

AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种重要的能量传感器，在整合细胞功能以维持体内平衡方面发挥着关键作用。尽管如此，以AMPK通路为靶点是否可以作为感染性疾病的治疗策略尚不清楚。在此，我们表明AMPK激活强烈诱导抗菌自噬，这有助于抗菌剂防御结核分枝杆菌（Mtb）。AMPK激活导致巨噬细胞中Mtb诱导的雷帕霉素（MTOR）机制靶点磷酸化受到抑制。此外，AMPK激活增加了Mtb感染巨噬细胞中参与氧化磷酸化、线粒体ATP生成和生物生成的基因。值得注意的是，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ，辅激活物1α（PPARGC1A）是AMPK介导的抗菌活性以及增强巨噬细胞线粒体功能和生物生成所必需的。此外，AMPK-PPARGC1A通路通过CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）、β（CEBPB）参与多个自噬相关基因的上调。PPARGC1A敲除抑制了AMPK介导的自噬诱导，并破坏了巨噬细胞中吞噬体与MAP1LC3B（LC3B）自噬体的融合。通过研究LysMCre介导的atg7基因敲除，进一步证明了自噬、线粒体功能和抗菌活性之间的联系，证明了线粒体超微结构缺陷和功能障碍，以及对分枝杆菌抗菌活性的阻断，我们的结果确定AMPK-PPARGC1A轴有助于自噬激活，从而导致抗菌反应，是一种新的宿主防御机制。

关键词：AICAR；AMP活化蛋白激酶；MTOR；结核分枝杆菌；PPARGC1A；自噬。

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数字

无
图1。AICAR诱导的自噬激活导致吞噬体成熟和对分枝杆菌感染的抗菌反应。(A和B)BMDM感染结核分枝杆菌（MOI=5）4小时，用或不用AICAR（0.1、0.5、1 mM）孵育4小时A类，0.5 mM用于B类)持续16小时(A类)收获细胞，然后用抗LC3、抗SQSTM1和抗ACTIN进行免疫印迹（IB）。(B类)细胞固定并用抗LC3B抗体进行免疫标记，然后用Alexa 488-结合的山羊抗兔IgG进行染色。流式细胞术分析LC3B的表达。（左）7个独立重复的代表性直方图。（右）平均荧光强度（MFI）。(C和D)用ERFP-Mtb（MOI=10）感染BMDM 4h，加或不加AICAR孵育24h，然后固定并用αLC3（Alexa 488）染色检测自噬体和DAPI。(C类)使用Imaris软件对结核分枝杆菌感染/AICAR治疗条件下的共聚焦z堆栈图像进行了获取和三维重建。插图，扩大轮廓区域。比例尺：5μm。另请参阅相应的视频1。(D类)共定位分析的定量数据（%）。自噬体标记物LC3（绿色）和含有ERFP-Mtb（红色）的细菌吞噬体之间的结肠化分析。另请参阅相应的视频1。(电子)骨髓间充质干细胞感染结核分枝杆菌，用AICAR治疗，并用透射电镜观察。比例尺：1µm。右侧面板中相应方框区域的放大视图（比例尺：200 nm）。（左）来自3个独立实验的典型TEM图像。（右）每种实验条件下200个内化分枝杆菌的定量（平均值±SD）。(F–H（飞行高度）)通过CFU分析评估结核分枝杆菌的细胞内存活率。(F类)骨髓基质干细胞感染结核分枝杆菌4h，然后与AICAR孵育3d(G公司)骨髓基质干细胞感染结核分枝杆菌，然后用3-MA（10μM；2 h）、沃特曼（100 nM）、氯喹（10μM）或巴非霉素A治疗1（100 nM），然后用AICAR（0.5 mM）培养3天(H（H）)用表达非特异性shRNA（sh）的慢病毒转导THP-1细胞-NS公司)或shRNA特异性BECN1公司（第页-BECN1公司),自动液位计5（第页-自动液位计5),自动液位计7（第页-自动液位计7)含聚brene（8μg/mL）。3d后，用结核分枝杆菌感染THP-1细胞，用AICAR处理，然后裂解以测定细胞内细菌负荷**P（P）<0.01和***P（P）<0.001（双尾学生t吨测试），指示。以上所有数据均表示3个实验的平均值±SD。SC，溶剂控制。CFU，结肠检查单位。
无
图2。在结核分枝杆菌感染的骨髓基质干细胞中，AICAR诱导的AMPK激活是MTOR抑制、自噬激活和抗菌活性所必需的。(A–D)AICAR对BMDM中AMPK的激活和MTOR的抑制。用AICAR（0.5mMA类)或Mtb（MOI=5，用于B类)适用于指定的时间。BMDM感染结核分枝杆菌4小时，用或不用AICAR（0.1、0.5、1 mM）孵育1小时(C和D)，然后用IB检测磷酸化形式的AMPKA、ACACA/B和ACTIN(A–C)或磷酸化和总形式的MTOR(B和D). (电子)用AMPK抑制剂化合物C（Comp C，10μM，1h）预处理的BMDM感染Mtb（MOI=10）4h，然后与AICAR孵育24h。细胞固定并标记Alexa 488-共轭抗LC3和DAPI。每个细胞LC3+点的定量分析。(F–H（飞行高度）)通过CFU分析评估结核分枝杆菌的细胞内存活率。(F和H)骨髓基质干细胞感染结核分枝杆菌，然后用Comp C治疗（1小时），然后用(F类; AICAR，0.5 mM）或不带AICAR(H（H）)持续3天(G公司)用表达非特异性shRNA（sh）的慢病毒转导BMDM-编号)或shRNA特异性AMPKa公司（第页-安普卡)含聚brene（8μg/mL）。3天后，用结核分枝杆菌感染BMDM，用AICAR处理，然后裂解以测定细胞内细菌负荷。（Top）半定量RT-PCR用于测定慢病毒转导的效率。所有数据均表示3个实验的平均值±SD*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（双尾学生t吨试验），与溶剂控制进行比较(F和H)或AICAR处理条件(G公司). SC，溶剂控制。CFU，结肠检查单位。ns，不显著。
无
图3。AICAR治疗增加了线粒体OXPHOS基因表达的诱导、ATP合成和Mtb感染巨噬细胞的线粒体质量。(A和B)AICAR诱导OXPHOS基因上调。骨髓基质干细胞感染结核分枝杆菌（MOI=5）4小时，与AICAR（0.5 mM）孵育6小时(A类)或指示的时间(B类)，并对OXPHOS基因进行实时定量PCR(A类)或通过荧光法定量细胞内ATP(B类). (C–E类)BMDM感染结核分枝杆菌4h，AICAR孵育24h(C类)通过流式细胞术分析评估线粒体荧光信号。（左）来自7个独立重复的代表性直方图。（右）条形图表示线粒体质量MFI。(D类)用共焦显微镜（60×）评估线粒体标记物TOMM20信号。右侧面板中相应方框区域的放大视图。比例尺：5µm。(电子)透射电子显微镜（TEM）。（上图）显示了3个独立实验的典型TEM图像。（底部）条形图表示线粒体数量。比例尺：1µm。所示数据来自至少3个独立实验的一个代表（三份的平均值±SD[A类–C类对，并且电子底部]样本）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（双尾学生t吨试验），与AICAR处理条件相比(A、 C和E). U、 未经处理的对照。
无
图4。AMPK诱导的PPARGC1A是Mtb-infected BMDM线粒体生物发生和ATP合成所必需的。(A类)AICAR诱导OXPHOS蛋白上调。BMDM感染结核分枝杆菌（MOI=5），用AICAR（0.5 mM）孵育指定时间，并用PPARGC1A、NFE2L1、TFAM、CYCS和ACTIN抗体进行IB分析。(B类)用表达非特异性shRNA（sh）的慢病毒转导BMDM-编号)或针对PPARGC1A的shRNA（sh-第1a部分)含聚brene（8μg/mL）。3天后，BMDM感染结核分枝杆菌（MOI=5）4 h，与AICAR（0.5 mM）孵育6 h，并进行实时定量PCR，以测定其mRNA表达Ppargc1a、Nfe2l1、Nfe2 l2、，和Tfam公司. (C类–电子)实验条件概述如下(B类). 用Mtb感染BMDM 4小时，用AICAR孵育16小时(C类)通过FACS分析评估MitoTracker荧光信号。（顶部）7个独立重复的代表性直方图。（底部）条形图，表示线粒体质量为MFI。(D类)使用ATP生物发光检测试剂盒荧光定量细胞ATP。(电子)通过定量实时PCR测量BMDM中的mtDNA含量。mtDNA含量归一化为核DNA。所示数据来自至少3个独立实验的一个代表（三份实验的平均值±SD(B类,C类底部，D类,电子)样品）*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（双尾学生t吨测试），与sh相比-编号(B–E类). U、 未经处理的对照。ns，无显著性。
无
图5。PPARGC1A是体外和体内对抗分枝杆菌的抗菌反应所必需的。(A类)慢病毒-sh转导后3d-NS公司或慢病毒-sh-第1a部分，BMDM感染Mtb（MOI=1或10）4 h，然后与AICAR孵育，然后裂解以测定细胞内细菌负荷。（右）半定量RT-PCR分析显示慢病毒转导的效率。(B类)（左）BMDM感染ERFP-Mtb（MOI=10）4h，与AICAR（0.5mM）孵育24h，然后固定并用抗LC3（Alexa 488）染色检测自噬体和DAPI。比例尺：5μm。（右）共定位分析的定量数据（%）。自噬体标记物LC3（绿色）和含有ERFP-Mtb（红色）的细菌吞噬体之间的结肠化分析。(C类)控制和第1部分突变苍蝇被感染海分枝杆菌（CFU=500），然后使用或不使用AICAR（1 mM）进行治疗。每隔1天对死苍蝇进行计数。误差条表示95%的置信区间。生存曲线的对数回归分析表明，每种情况（n=120）都有显著差异(***P（P）< 0.001). (D类)3天后，每组苍蝇被收获、均质并通过CFU分析进行量化。实验重复3次。所示数据来自至少3个独立实验的一个代表（三份实验的平均值±SD(A类,B类正确的，D类)样品）***P（P）<0.001（双尾学生t吨测试），与sh相比-编号(B类). SC，溶剂控制。CFU，结肠检查单位。ns，不显著。
无
图6。AMPK-PPARGC1A通路是通过CEBPB上调巨噬细胞中多个自噬相关基因所必需的。(A类)用表达非特异性shRNA（sh）的慢病毒转导BMDM-NS公司)或PPARGC1A的特定shRNA（sh-第1a部分). 3天后，用Mtb（MOI=5）感染BMDM 4小时，然后用AICAR（0.5mM）孵育6小时，然后进行RT-PCR分析附件5,贝肯1,Lc3b公司,第1a部分、和Gapdh公司. (B类)用表达sh的慢病毒转导Raw264.7细胞-NS公司或sh-第1a部分然后用pGL3-basic、pGL3-ATG5-1P或pGL3-ATM5-3P（Top）、pGL3-basic、pGL3-BECN1-1P或pGL3-BECN1-3P（Middle）或pGL3-基本、pGL3-4TG7-1P或pGL3-ATG7-2P（Bottom）荧光素酶报告子构建体转染。48 h后，细胞感染结核分枝杆菌（MOI=5）4 h，用AICAR（0.5 mM）孵育6 h，然后进行荧光素酶分析。测定荧光素酶活性，并将其归一化为Renilla荧光素酶活性。(C类)人体示意图自动液位计5（顶部），BECN1公司（中间），和自动液位计7（底部）promoter-reporter构造生成。位于基因5′-侧翼区域的潜在CEBPB结合位点ATG5、BECN1、，和自动液位计7显示为带编号的框。括号中的数字表示与共识相匹配的残数。n=A、T、G或C；K=G或T；*，反义定向。(D和E)实验条件概述如下(B类). (D类)THP-1细胞与干扰对照siRNA（siRNA）共转染-NS公司)或si-CEBPB公司与pGL3-basic、pGL3-ATG5-1P或pGL3-ATG5-3P（顶部）、pGL3-basic、pGL3-BECN1-1P或pGL3-BECN1-3P（中部）或pGL3-基本、pGL3-1P或pGL3-ATG7-2P（底部）荧光素酶报告子构建物一起使用(电子)用表达sh的慢病毒转导Raw264.7细胞-NS公司或sh-第1a部分然后用pGL3碱性或pGL3-CEBPB荧光素酶报告体转染。启动子活性通过萤光素酶测定法测定。(F和G)实验条件概述如下(A类). 用结核分枝杆菌（MOI=5）感染BMDM 4 h，用AICAR（0.5 mM）孵育16 h(F类)收集细胞，然后用带有抗LC3、抗PPARGC1A和抗ACTIN的IB。所示数据来自至少3个独立实验的1个代表（平均值±SD，一式三份(B、 D和E)样品）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（双尾学生t吨测试），与sh相比-NS公司(B、 D和E). U、 未经处理的对照。ns，不显著。
无
图7。巨噬细胞自噬缺陷导致线粒体功能障碍和分枝杆菌细胞内生长增加(A类到F类)附件7飞行/飞行LysM-Cre+和附件7飞行/飞行LysM-Cre-BMDMs感染结核分枝杆菌（MOI=5）4 h，然后用AICAR（0.5 mM）治疗24 h(A–C、E和F)或6小时(D类). (A类)收集细胞，然后用IB和抗LC3、抗SQSTM1、抗ATG7和抗ACTIN。(B类)细胞感染结核分枝杆菌，与AICAR孵育，然后使用ATP生物发光检测试剂盒荧光定量细胞ATP。(C类)使用电位荧光探针（TMRE）测量线粒体膜电位（ΔΨm），然后进行流式细胞术分析。(D类)用实时定量PCR测定骨髓基质干细胞mtDNA含量。mtDNA含量归一化为核DNA。(电子)透射电子显微镜（TEM）分析附件7飞行/飞行LysM-Cre+BMDM感染了结核分枝杆菌（MOI=10），随后接受AICAR治疗。比例尺：1µm。(F类)共定位分析的定量数据（%）。自噬体标记物LC3（绿色）和含有ERFP-Mtb（红色）的细菌吞噬体之间的结肠化分析。(G和H)结核分枝杆菌的细胞内存活(G公司)或卡介苗(H（H）)通过CFU分析评估。附件7飞行/飞行LysM-Cre+和附件7飞行/飞行LysM-Cre-BMDMs感染了结核分枝杆菌(G公司)或卡介苗(H（H）)用AICAR（0.5 mM）孵育4 h，然后裂解以测定细胞内细菌负荷。(我)小鼠感染BCG（1×107CFU/小鼠静脉注射）3周，然后AICAR（500 mg/kg，静脉注射）连续治疗3天。卡介苗感染4周后处死小鼠，用CFU法测定感染小鼠（每组5只）脾脏的细菌负荷。所示数据来自至少3个独立实验的一个代表（三份的平均值±SD(B类,D类,F–I型)样本）*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（双尾学生t吨测试），与附件7飞行/飞行LysM-Cre-公司(B和D)或AICAR治疗条件(G和H). U、 未经处理的对照。SC，溶剂控制。CFU，结肠检查单位。ns，不显著。
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