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。2014年4月；25(8):1287-97.
doi:10.1091/mbc。E13-11-0644。 Epub 2014年2月12日。

浓度依赖性层粘连蛋白组装及其在其他核蛋白定位中的作用

郭宇轩 1, Youngjo Kim（金永雄）, 石井武, 罗伯特·D·戈德曼, 郑义贤
附属公司

浓度依赖性层粘连蛋白组装及其在其他核蛋白定位中的作用

郭宇轩等。 分子生物学细胞。 2014年4月。

摘要

核纹层（NL）由层粘连聚合物和与聚合物结合的蛋白质组成。NL蛋白如层粘连蛋白和emerin的破坏会导致发育缺陷和人类疾病。然而，哺乳动物中多种层粘连蛋白的表达，包括层粘连A/C、层粘连B1和层粘连B2，使得研究NL的组装和功能变得困难，目前尚不清楚不同的层粘连是否相互依赖以进行正确的NL组装，以及哪些NL功能是由所有层粘连共享的，哪些是特定于一个层粘连的。使用删除所有或不同层粘连组合的小鼠细胞，我们证明每个层粘连组装成NL主要取决于细胞核中的层粘连浓度。当以足够高的水平表达时，每个层粘连蛋白可以单独组装成一个均匀组织的NL，这反过来足以确保核孔复合物的均匀分布。相比之下，只有层粘连蛋白-A才能确保emerin在NL内的定位。因此，在研究NL在发育和疾病中的作用时，确定相关层粘连的蛋白水平以及相关组织中复杂的共享或特定层粘连功能至关重要。

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数字

图1：
图1：
lamin-B1对mESCs中lamin-A/C和lamin-B2组装的影响。（A，B）野生型（WT）lamin-A/C的免疫荧光图像，最小1−/−; Lmnb2（磅2）−/−（DKO），Lmna公司−/−;最小1−/−;Lmnb2（磅2）−/−（TKO），最小1−/−（LB1 KO），以及Lmnb2型−/−（LB2 KO）mESC。箭头所示为沿核周不连续的层粘连-A/C染色。（C） WT和LB2 KO mESCs中的Lamin-B1染色。（D） WT和LB1 KO mESCs的Lamin-B2染色。箭头表示沿着核周边的不连续的lamin-B2染色。（E） LB1 KO mESCs中lamin-A/C和lamin-B2的双重标记。右，轮廓细胞核增大。比例尺，5μm。
图2：
图2：
Lamin-B1调节EDFC中Lamin-A/C和Lamin-B2的组装。（A） WT、LB1 KO、LB2 KO和DKO EDFC中层粘连蛋白A/C的免疫荧光图像。（B） EDFC中不同层粘连A/C染色模式的示例可分为均匀排列的网状结构、松散网状结构、部分网状结构或斑片状结构。箭头表示丝状结构的松散网格。箭头表示聚集或短纤维。虚线用部分和片状的层粘连-A/C模式描绘了细胞核的边界。对，不同定量和标绘的层粘连蛋白A/C模式。误差条，SD(n个=3个实验，每个实验计数>200个细胞）。使用与B.（E）LB1 KO EDFC中Lamin-A/C和Lamin-B2的双重标记相同的方法，在野生型或Lamin-B单KO EDFCs中进行（C，D）Lamin-B1（C）或Lamin-B2（D）染色，并进行定量（图在底部）。比例尺，5μm或按规定。
图3：
图3：
B型层粘连缺失的MEF中层粘连A/C的浓度依赖性组织。（A） 用对照（siCtrl）或lamin-A/C（siLA/C）siRNA处理的MEF中lamin-A-C的免疫荧光图像。箭头表示层粘连-A/C染色的间隙。（B） MEFs和EDFCs中层粘连蛋白A（LA）和层粘连蛋白C（LC）的蛋白质印迹分析。Tubulin（Tub），装载控制。（C） MEF中椎板层A/C形态的量化。误差条，SD(n个=3个实验，每个实验计数>200个细胞）。（D，E）MEF中lamin-B1（D）和lamin-B2（E）定位的图像。对，层压板形态的量化。D中的箭头表示小的层粘连蛋白B1染色间隙。比例尺，10μm。
图4：
图4：
层粘连蛋白B1在MEFs中的表达水平高于层粘连蛋白B2。（A） 纯化LB1T、LB2T和BSA的考马斯蓝染色。以BSA为标准对LB1T和LB2T（虚线框）进行定量。5×10的全细胞裂解物中的（B，C）层粘连蛋白B1（B）和层粘连蛋白质B2（C）4分别以LB1T和LB2T为标准，通过Western blotting分析对来自两个野生型胚胎（1和2）的MEF进行定量。箭头表示全长（FL）LB、LB1T或LB2T。（D） 一个MEF中的lamin-B1和lamin-B2的量。误差条，SD(n个=3个实验）。
图5：
图5：
当在高水平表达时，仅拉明-A、-B1或-B2可以组装成均匀的NL。TKO mESCs（A）或EDFCs（B）中表达的未标记层粘连蛋白-A、-B1或-B2的免疫荧光图像。为了可视化层粘连蛋白在表达低水平蛋白质的细胞中的分布，调整了图像的亮度和对比度，揭示了不均匀的结构。（C） 对均匀或不均匀染色的TKO-EDFCs细胞核中每个层粘连蛋白的免疫荧光强度进行了量化，并通过盒须图（a.u.，任意单位）显示。上下胡须分别代表最大值和最小值。方框的上下边界分别表示第75个和第25个百分位。框内的线表示中间值。十字表示平均值。在每种情况下分析了80多个细胞。比例尺，5μm。
图6：
图6：
层蛋白在调节分化细胞中NPC分布方面具有共同的功能。（A，B）NPC在EDFC（A）和MEF（B）中的分布，如NPC核篮中的核孔蛋白TPR的免疫荧光染色所示。（C） 对均匀和不均匀的鼻咽癌分布进行量化和绘制，并在两个实验中分析>200个细胞。（D） 在lamin-B DKO EDFC中用mAb414双重标记NPC和lamin-A/C。（E） 在TKO-EDFCs中表达的NPC（mAb414）和所指示的层粘连蛋白的双重标记。箭头和箭头分别表示NPC分布均匀或不均匀的单元格。虚线描绘了未转染细胞中细胞核的边界。（F） 量化NPC在TKO EDFC中的分布，这些EDFC要么不表达层粘连蛋白，要么显示在细胞核中存在缺陷或均匀分布的层粘连。比例尺，5μm。
图7：
图7：
核滞留和emerin分布中对lamin-A的特殊要求。（A，B）免疫荧光显微镜显示emerin在EDFCs（A）和MEFs（B）中的分布。（C） 根据emerin在指定细胞和处理中是单核的还是核和细胞质的，量化emerin定位。在两个实验中，每个实验都分析了200多个细胞。（D） emerin和TKO EDFCs中表达的指定层粘连蛋白的双重标记。箭头表示emerin在均匀分布的lamin-A细胞中的核滞留。（E） 表达所示层粘连蛋白的TKO EDFC中emerin分布的定量（在两个实验中分别分析了>50个细胞）。（F） DKO EDFC中emerin和lamin-A/C的双重标记。共定位层粘连蛋白A/C（绿色）和emerin（洋红色）呈白色。比例尺，5μm。
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参考文献

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