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.2014年1月7日；111（1）：E34-43。
doi:10.1073/pnas.1312701111。 Epub 2013年12月18日。

帕金森相关LRRK2突变R1441C/G/H损害LRRK2的PKA磷酸化并破坏其与14-3-3的相互作用

凯瑟琳·穆达 1, 丹妮拉·贝蒂内蒂, 弗兰克·盖塞尔琴, 詹妮弗·莎拉·赫尔曼, 费利克斯·冯·兹韦多夫, 阿里·吉尔洛夫, 阿内特·雅各布, 马吕斯·尤芬, 克里斯蒂安·约翰内斯·格洛克纳, 弗里德里希·W·赫伯格
附属公司

帕金森相关LRRK2突变R1441C/G/H损害LRRK_2的PKA磷酸化并中断其与14-3-3的相互作用

凯瑟琳·穆达等。 美国国家科学院程序. .

摘要

富含亮氨酸重复激酶2（LRRK2）是一种与帕金森病（PD）相关的多域蛋白；然而，这种蛋白质的分子机制和作用模式仍然难以捉摸。cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）与其他激酶一起被认为是调节LRRK2功能的上游激酶。使用MS，我们检测到几个被PKA磷酸化的位点，包括复合蛋白（ROC）GTPase结构域Ras内的磷酸化位点以及一些先前描述的位点（S910和S935）。我们系统地绘制了LRRK2内的这些站点，并调查了它们的功能后果。使用ROC单结构域构建物并通过定点突变，证实ROC结构域中的S1444是PKA磷酸化的靶点。S1444处的磷酸化在PD-related LRRK2的主要突变R1441C/G/H中显著降低，这些突变是共同PKA识别位点的一部分（（1441）RASpS（1444））。此外，我们的工作将S1444确立为PKA管制的14-3-3对接场地。与包含pS910、pS935或pS1444的磷酸肽直接结合到三个14-3-3等型γ、θ和zeta的实验表明，与磷酸-S1444的亲和力最高。引人注目的是，14-3-3与磷酸化S1444结合可降低体外LRRK2激酶活性。此外，用丙氨酸替代S1444或引入突变R1441C/G/H，消除PKA磷酸化和14-3-3结合，导致LRRK2激酶活性增加。总之，这些数据清楚地表明，LRRK2激酶活性受PKA介导的14-3-3与S1444的结合调节，并表明在R1441C/G/H介导的PD发病机制中，14-3-3和LRRK_2的相互作用受到阻碍。

关键词：cAMP依赖性蛋白激酶；致病性突变；蛋白质-蛋白质相互作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
S910和S935都是LRRK2中的PKA磷酸化位点。(A类)体外用PKA磷酸化从昆虫细胞表达系统纯化的StrepII/Flag-tagged LRRK2 WT。产品在4–12%梯度凝胶上分离，并使用针对pS910和pS935的磷酸化特异性抗体进行Western blot分析。(B类)在用StrepII/Flag标记的LRRK2 WT转染48小时后，COS7细胞被血清饥饿4小时，然后在37°C下与50µM FSK和100µM IBMX孵育30分钟。随后用Strep-Tactin Superflow富集LRRK2，用SDS/PAGE分离，并用抗p910或抗p935抗体进行免疫印迹。Amido Black染色证实蛋白质载量相等。
图2。
图2。
S1443和S1444是PKA的靶点，在PD-related LRRK2突变R1441C/G/H中未磷酸化(A类)在不存在PKA抑制剂PKI（10µM）和放射性标记的ATP的情况下，单独培养分离的ROC片段WT（氨基酸1334–1516）或与PKA一起培养。反应产物通过SDS/PAGE进行分离，并通过放射自显影进行可视化。(B类)不同物种中新鉴定的PKA磷酸化位点S1443和S1444附近氨基酸的序列比对。强调了P-3精氨酸（R1441）和磷酸化位点（S1443和S1444）的位置。人类蛋白质序列(智人; GenBank登录号Q55007），黑猩猩(黑猩猩; GenBank登录号H2Q5Q4），rat(褐家鼠; GenBank登录号F1LNJ1），小鼠(小家鼠; GenBank登录号Q5S006），猪(苏斯克罗法; GenBank登录号A9XXE0）和牛(Bos金牛; GenBank登录号E1BPU0）。(C类)分离的WT和突变体（S1443A、S1444A和S1443_S1444A）ROC结构域构建物与PKA孵育；放射性通过放射自显影进行评估，并通过闪烁计数进行定量(D类). (E类和F类)对ROC R1441C/G/H的PKA磷酸化进行了研究，如下所述C类和D类考马斯染色显示负载相等。(D类和F类)PKA的ROC磷酸化被归一化为WT。数据是三个实验的平均值，误差条显示±SEM.n.s.，不显著；***，P（P）与ROC WT相比<0.0001，通过单向方差分析和Tukey的事后检验计算。
图3。
图3。
LRRK2上的S1444是PKA诱导的14-3-3结合位点。(A类)LRRK2的多域结构。ANK，锚蛋白重复区；LRR，富含亮氨酸重复结构域；ROC，复合物Ras（GTPase）；COR，ROC的C端子。LRRK2中潜在的14-3-3相互作用基序显示并与模式I 14-3-3结合一致序列对齐。已知致病突变R1441C/G/H和G2019S已被指出。(B类)LRRK2下拉与重组GST–14-3-3γ。LRRK2 WT和LRRK2WT∆967在Sf9细胞中表达。将裂解液与GST–14-3-3γ孵育4 h。GST–14-3-3γ拖曳LRRK2 WT全长和LRRK2WT∆967。样品在4–12%梯度SDS凝胶上分离，用Strep-Tactin HRP或GST抗体探测膜。(C类)在化学合成LRRK2肽（LFNIKARASS公司SPVILVGT）在S1444处磷酸化或非磷酸化。按照以下说明进行样品分离和蛋白质印迹B类. (D类)将两微克His-ROC WT、S1443A、S1440A或S1443A-S1444A突变蛋白在有或无PKA的条件下在30℃下培养1小时。以GST-14-3-3蛋白为探针进行远western印迹。只有当S1444存在时，才能观察到PKA诱导的ROC–GST–14-3-3相互作用。使用抗-His抗体证明负载量相等。
图4。
图4。
GST–14-3-3与与LRRK2新识别的14-3-3结合区相对应的合成肽的结合。直接FP分析：在激酶缓冲液中存在或不存在500 nM PKA的情况下培养20 nM荧光标记的LRRK2肽。在PKA特异性抑制剂PKI（10µM）存在下进行对照实验。每个数据点代表三次测量的平均值±SEM。
图5。
图5。
GST–14-3-3与合成肽相互作用的SPR分析，合成肽对应于LRRK2 S1444的新鉴定的14-3-3结合区。通过生物素连接剂将60纳米摩尔的未磷酸化（S1444，灰线）或磷酸化（pS1444（黑线））的S1444肽固定到传感器表面，并在表面注入14-3-3（γ、θ或zeta，各1µM）。只有磷酸化肽与不同的14-3-3蛋白结合。与γ同种型相比，14-3-3θ和ζ的最大SPR信号降低，表明对pS1444的亲和力较低。
图6。
图6。
LRRK2激酶活性由S1444和14-3-3结合的磷酸化调节。(A类)LRRK2 WT、S1444A、R1441H和G2019S的活性通过使用GST–moesin作为底物的放射性体外激酶分析测定。通过放射自显影术观察探针。样品在同一凝胶上进行分析，通过考马斯染色确认蛋白质载量相等。(B类)成立32液体闪烁法测定LRRK2蛋白带中的P。误差条代表±SEM，显示了三个独立实验的结果（单向方差分析和Tukey的事后检验）。**，P<0.001；***，相对于LRRK2 WT，P<0.0001(C类)LRRK2 WT、R14441H和S1444A的激酶活性也通过在体外PKA和/或GST–14-3-3γ存在下的LRRK1自动磷酸化进行测量。用抗pT2483抗体进行免疫印迹，Amido Black染色保证蛋白质载量相等。
图7。
图7。
通过PKA介导的14-3-3与ROC GTPase结构域结合调节LRRK2激酶活性的模型。基于实验数据，我们提出了一个模型，其中LRRK2激酶活性由构象变化控制，该构象变化驱动激酶进入非活性状态，并通过与pS910和pS1444（标记为红色）的14-3-3相互作用来稳定。ROC GTPase结构域中S910和S1444的磷酸化由PKA的催化亚基介导。S1444磷酸化在R1441的PD-related LRRK2突变中被消除，从而阻止PKA介导的LRRK2-激酶活性的衰减。
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