Q6, a novel hypoxia-targeted drug, regulates hypoxia-inducible factor signaling via an autophagy-dependent mechanism in hepatocellular carcinoma

doi:10.4161/auto.26838

.2014年1月；10（1）：111-22。

doi:10.4161/auto.26838。 Epub 2013年11月11日。

新型缺氧靶向药物Q6通过自噬依赖性机制调节肝细胞癌缺氧诱导因子信号传导

刘晓文¹, 田玉才¹, 洪朱¹, 曹季军¹, 易素¹, 胡永洲², 何乔军¹, 杨波（Bo Yang）¹

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¹浙江省抗癌药物研究重点实验室；药理学和毒理学研究所；药学学院；浙江大学；中国杭州。
²浙江-恩施药物化学联合实验室；药学学院；浙江大学；中国杭州。

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新型低氧靶向药物Q6通过自噬依赖机制调节肝细胞癌低氧诱导因子信号转导

刘晓文等。自噬. 2014年1月.

.2014年1月；10(1):111-22.

doi:10.4161/auto.26838。 Epub 2013年11月11日。

作者

刘晓文¹, 田玉才¹, 洪朱¹, 纪曹¹, 易素¹, 胡永洲², 何乔军¹, 杨波（Bo Yang）¹

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¹浙江省抗癌药物研究重点实验室；药理学和毒理学研究所；药学学院；浙江大学；中国杭州。
²浙江-恩施药物化学联合实验室；药物科学学院；浙江大学；中国杭州。

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摘要

肿瘤缺氧是治疗失败的基础，并产生更具侵袭性和转移性的癌症表型。尽管针对这些缺氧环境的治疗已经提出多年，但迄今为止，还没有任何方法显示出获得监管部门批准的治疗价值。在这里，我们证明了一种新型低氧活化前药Q6在缺氧条件下表现出强大的抗增殖作用，并在2个肝细胞癌（HCC）细胞系中诱导caspase依赖性凋亡，而在2个正常肝细胞系中未检测到明显毒性。Q6治疗显著下调下游靶基因VEGFA（血管内皮生长因子A）的HIF1A[低氧诱导因子1，α亚单位（碱性螺旋-环-螺旋转录因子）]表达和转录。这种双重低氧靶向调节机制在2种体内模型中可高效抑制肿瘤生长和血管生成。有趣的是，在Q6诱导的HIF1A表达减弱中起关键作用的是自噬依赖性降解途径，而不是蛋白酶体依赖性途径，通常被视为HIF1A翻译后调控的主要机制。通过短干扰RNA（siRNA）或化学抑制剂抑制自噬，阻止Q6诱导的HIF1A降解。HIF1A与泛素结合适配器蛋白SQSTM1共免疫沉淀，通过自噬降解，进一步证实了HIF1A的自噬性降解。此外，沉默SQSTM1抑制Q6诱导的HIF1A降解。这些发现表明，新型低氧靶向药物Q6在肝癌治疗中具有潜在的临床价值。此外，自噬作为HIF1A的关键调节因子的鉴定为低氧相关治疗提供了新的见解。

关键词：自噬；双重调制机制；低氧活化前药；翻译后调控；靶向治疗。

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数字

**图1。**Q6具有强大的抗肿瘤作用，并在2个肝癌细胞株中触发caspase依赖性凋亡。(**A和B**)两个肝癌细胞株HepG2（左）和Bel-7402（右）在常氧或缺氧条件下用Q6或TPZ（0至12.5μM）处理72小时。用MTT法测定细胞活力。数据代表3个独立实验，表示为平均值±SD(**C和D**)HepG2和Bel-7402细胞在常氧或缺氧条件下用Q6或TPZ（0，10μM）或Q6（0至10μM，Z-VAD-FMK（40μM）处理24 h。(C类)使用ANXA5/PI凋亡检测试剂盒通过流式细胞术测量凋亡百分比。进行了三个独立实验，数值表示为平均值±SD(D类)通过蛋白质印迹分析检测PARP1的蛋白质水平。测定ACTB作为负荷控制。数据代表了3个独立实验。

**图2。**Q6下调缺氧诱导的HIF1A蛋白表达和HIF1A介导的信号转导。(**A和C**)HepG2（左）和Bel-7402（右）细胞暴露于低氧或常压下，用Q6（0-5μM）处理6h(A类)western blot分析检测HIF1A、EPAS1和VEGFA的蛋白水平。分析ACTB作为负荷控制。数据代表了3个独立实验。(B类)使用HRE依赖性报告分析来确定Q6对HIF1A转录活性的影响。进行了五个独立实验，数值表示为平均值±SD***P（P）*<0.01和****P（P）*与未经治疗的缺氧对照组相比，<0.001。(C类)提取总RNA蔬菜mRNA表达通过RT-PCR分析，使用*GAPDH公司*作为控制基因。进行了五个独立实验，数值表示为平均值±SD***P（P）*与未经处理的对照组相比，缺氧组的差异非常显著。

**图3。**Q6通过自噬-溶酶体途径加速HIF1A蛋白降解。(A类)HepG2（左）和Bel-7402（右）细胞在缺氧条件下暴露于Q6（0-5μM）6 h。提取总RNAHIF1A型mRNA表达通过RT-PCR分析，使用*GAPDH公司*作为控制基因。进行了五个独立实验，数值表示为平均值±SD(B类)在Q6（5μM）存在或不存在的情况下，用CHX处理缺氧HepG2和Bel-7402细胞不同时间，然后通过western blot分析测定HIF1A蛋白水平。测定ACTB作为负荷控制。(C类)用MG132（蛋白酶体抑制剂）或3-MA（自噬溶酶体抑制剂）预处理HepG2和Bel-7402细胞30分钟，以实现蛋白酶体和溶酶体的功能抑制。然后将细胞暴露于有无Q6（5μM）的缺氧条件下6 h，然后通过western blot分析测定HIF1A蛋白水平。测定ACTB作为负荷控制。(D类)用电子显微镜分析了经或不经Q6处理（5μM）6h后HepG2和Bel-7402细胞的超微结构特征。高倍镜下显示自噬体（箭头）和自溶体（箭头形）的典型图像。在下面板中，显示了HepG2和Bel-7402细胞的自噬体（AP）和自溶体（AL）数量。每个实验计算20个横截面。所示数据为3个独立实验的平均值±标准差**P（P）*与HepG2对照组相比<0.05***P（P）*与HepG2对照组相比<0.01。^## *P（P）*与Bel-7402对照组相比P<0.01。(E类)用Q6（0～5μM）处理HepG2和Bel-7402细胞6h，并通过western blot分析测定LC3B-I和LC3B-II蛋白水平。测定ACTB作为负荷控制。数据代表了两个独立的实验。

**图4。**ATG5和LC3B是Q6诱导的自噬和HIF1A降解所必需的。(**A和B**)用特异性靶向siRNA转染后(*自动液位计5*或*LC3B公司*)36 h后，用Q6（0、2.5、5μM）处理HepG2和Bel-7402细胞6 h，然后用western blot分析检测HIF1A、ATG5和LC3B蛋白水平。测定ACTB作为负荷控制。(**C和D**)用特异性靶向siRNA转染后(*自动液位计5*或*LC3B公司*)用Q6（5μM）处理HepG2和Bel-7402细胞36h，不同时间后用western blot分析检测HIF1A蛋白水平。测定ACTB作为负荷控制。(E类)缺氧条件下，用Q6（0，5μM）处理HepG2细胞6h，免疫电镜检测HIF1A蛋白。箭头表示HIF1A。在下面的面板中，显示了HepG2细胞的免疫金标记HIF1A的数量。每个实验计算20个横截面，共检测到40个自噬体。所示数据为3个独立实验的平均值±SD***P（P）*与对照组相比<0.01。

**图5。**SQSTM1调节HIF1A的降解。(A类)HepG2和Bel-7402细胞在有/无巴非霉素A的情况下暴露于Q6（0,5μM）₁（BafA1；0.2μM）缺氧6h，然后用共焦显微镜分析HIF1A和SQSTM1蛋白水平。比例尺，20μm。(B类)HepG2（左）和Bel-7402（右）细胞用Q6（0,5μM）或Q6（0.5,5μM）+巴非霉素A处理₁（0.2μM）6小时，然后通过免疫沉淀或蛋白质印迹测定蛋白质表达水平。10%用于IP的裂解液用于WCL。(C类)转染后*平方毫米1*siRNA处理36 h，HepG2（左）和Bel-7402（右）细胞用Q6（0，2.5，5μM）处理6 h，然后用western blot分析检测HIF1A蛋白水平。测定ACTB作为负荷控制。

**图6。**Q6抑制体内肿瘤生长。(**A–E**)通过每日腹腔注射25或12.5 mg/kg TPZ或Q6治疗患有既定Bel-7402肿瘤的裸鼠27天(A类)肿瘤体积表示为平均值±SEM****P（P）*<0.001与车辆治疗对照组（每组5至8个）。(B类)相对体重表示为平均值±SEM***P（P）*与车辆治疗对照组相比，<0.01（n=5至8/组）。(C类)用Q6（12.5 mg/kg）或载体治疗的Bel-7402细胞源性肿瘤，进行PARP1、CASP3、裂解-CASP3、HIF1A和VEGFA表达的Western blot分析。测定ACTB作为负荷控制。(**D和E**)通过苏木精-伊红染色、免疫组织化学和免疫荧光分析测定Q6对Bel-7402细胞源性肿瘤HIF1A和VEGFA表达水平的影响。(F类)示意图描述了Q6发挥抗癌作用的机制。一方面，Q6在体内外均可触发caspase依赖性凋亡途径，诱导肝癌细胞死亡。另一方面，Q6激活ATG5和LC3B依赖的自噬途径，在HIF1A降解以及Q6的抗血管生成和抗转移活性中发挥重要作用。此外，与SQSTM1的相互作用调节HIF1A的降解。因此，这些数据有力地支持Q6是一种新型低氧靶向药物治疗肝癌的结论，我们认为自噬通过加速HIF1A降解和阻止血管生成和转移过程发挥肿瘤抑制作用。

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