可逆基因陷阱收集增强人类细胞单倍体遗传学

单倍体基因捕捉突变体生成平台

基于基因陷阱的插入突变是通过随机插入剪接受体，然后将GFP标记和终止序列插入基因组，从而干扰基因表达。必须确定插入位点以识别被破坏的基因。额外引入短而独特的DNA序列作为细胞基因组的条形码，可以方便地追踪复杂混合物中的单个克隆，从而实现高效的混合筛选。此外，条形码极大地促进了使用大规模并行测序从多孔板中检索单细胞克隆。因此，我们将随机22-bp DNA序列引入逆转录病毒基因陷阱载体中，以获得高复杂度的条形码向量库(图2a). 我们感染感染倍数小于0.1的KBM7细胞，并将其置于FACS中以检测GFP的表达。尽管GFP公司转基因是无启动子的，基因间或反义插入可能导致低GFP表达，可能是因为长末端重复活性或（神秘的）基因组启动子活性。因此，并非所有GFP⁺克隆破坏了基因的插入。随后，我们使用限制稀释策略接种细胞，将其扩展到96个平板中，并将其储存在液氮中(图2b). 我们绘制了单个克隆的插入位点(图2c和联机方法); 插入位点和DNA条形码序列的例子显示在补充表7.

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图2

用于生成单倍体“基因标记”细胞的管道。

(一)逆转录病毒基因捕捉载体示意图。SA，剪接受体；LTR，长端子重复。条形码是使用网关克隆策略引入的。(b条,c（c）)克隆生成概述(b条)和条码位置映射(c（c）).

使用这个管道，我们映射了23468个具有相同数量唯一条形码的克隆(图3a). 其中，321个克隆在编码外显子中包含基因陷阱插入，直接破坏了各自的开放阅读框架。如果基因捕获盒插入到感观取向中，则内含子中的插入被预测为诱变。在11766个内含子插入事件中，预计约50%（6352）会影响相应基因的表达。在3396个被捕获的基因中，67%（2289个基因）在FPKM（每百万片段外显子千基片段数）>3处表达，81%（2755个基因）表达在FPKM>1处。正如预期的那样，在捕获的基因中，诸如参与核糖体生物生成、剪接和氨基酸代谢的关键基因未得到充分表达(补充图1和补充表8).

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图3

基因标记突变体是可逆的，可以类似于基因敲除。

(一)高通量测序管道中绘制的所有基因陷阱整合位点的分布。(b条)逆转录病毒基因捕捉载体示意图，包括平行液氧磷重组位点和品红箭头指示PCR分析的引物位点（顶部）。用逆转录病毒编码和他莫昔芬诱导的Cre重组酶感染克隆4天后的基因组DNA PCR分析。亲代KBM7细胞作为PCR特异性的阴性对照（C）。SA，剪接受体；LTR，长端子重复。(c（c）)用基因陷阱阻断p53表达的KBM7细胞进行Western blot，用Cre重组酶治疗和不治疗。亲代KBM7细胞被用作p53表达的对照。(d日)对指定克隆的mRNA进行RT-PCR分析。设计位于整合位点两侧的外显子PCR引物（如右图所示），用于从顶部所示的突变体中扩增cDNA。(e（电子）)所示克隆的Western blot分析。每个抗体识别的抗原显示在右侧。

由于逆转录病毒载体显示出整合偏差，新捕获的基因比例随着收集的大小而减少。我们使用我们的载体观察到的偏差与之前报道的基于小鼠白血病病毒（MLV）的载体的偏差非常相似²²(补充图2). 我们模拟了捕获的基因和映射的克隆之间的关系，以研究使用我们的策略可以恢复的表达基因的比例(补充图3和4). 根据这一分析，我们估计，要恢复8000个捕获的基因（>表达基因组的75%），需要约35000个突变克隆，这在使用当前平台的范围内。

对171个克隆的FACS分析表明，143个克隆（约84%）在培养4-6周后仍保持单倍体。此外，对八个突变克隆进行的高密度SNP分析显示，只有少数微小的遗传改变，表明遗传漂变有限(补充表9). 有关所有克隆的信息，请访问http://clones.haplogen.org/和中补充表10.

单倍体基因陷阱突变体类似基因敲除

我们使用包含基因捕获盒的载体生成了大多数突变克隆，该载体两侧有液氧磷地点。对于带有内含子插入和液氧磷位点（62%），这允许可逆的基因失活(图3b). 事实上，在感染表达Cre重组酶的逆转录病毒后，基因捕获盒很容易被切除。此外，蛋白质表达得到了恢复，尽管并非所有检测克隆都完全恢复(图3c和补充图5). 这表明在某些情况下，剩余的逆转录病毒和液氧磷序列影响基因转录。

为了说明基因捕捉盒的剪接受体被细胞剪接机制有效利用，从而干扰相关基因转录，我们首先使用了基于逆转录酶（RT）-PCR的验证方法。我们设计了位于基因陷阱插入位点两侧的引物，并用它们从选定的克隆中扩增cDNA。正如预期的那样，基因标签高效剪接到内源性转录物中导致PCR产物的缺失(图3d). 然而，并非所有克隆都显示出PCR产物数量的大幅减少（数据未显示）。尽管在某些情况下，这可能是由于分析的技术局限性所导致的，但这表明在部分克隆中，基因陷阱插入并没有有效地干扰表达。

对于第二组克隆，我们分析了蛋白质表达并进行了定量（q）RT-PCR分析(图3e和补充表10). 低mRNA水平导致在蛋白质水平上无法检测到表达(图3e和补充表11). 我们的结论是，单倍体KBM7细胞的基因捕获可以导致与传统敲除类似的近完全基因失活。

SNP阵列、外显子组、基因组和RNA测序

使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（Promega）提取DNA。将DNA与全基因组人类SNP 6.0阵列（Affymetrix）杂交，并使用基因分型控制台4.1.1版软件（Affmetrix）分析染色体拷贝数变化的数据。检测到chr.11p上的删除包含AMBRA1、，参与自噬的基因³⁵.

基因组DNA文库使用TruSeq DNA LT Sample Prep-Kit v2生成，外显子富集使用TruSeg exome enrichment Kit（均来自Illumina）进行。将这些文库与Illumina流式细胞V3杂交，并在Illumiana HiSeq 2000仪器上测序（3700万个50-bp双端读用于全基因组测序，1065万个100-bp双端读用于全基因测序）。此外，对第二批独立的野生型细胞进行全基因组测序（2.36亿个60-bp和1.79亿个75-bp配对基因读取）。读数与hg19参考基因组比对（Burrows-Wheeler Aligner 0.5.9-r16；参考。36)使用SAM工具去除潜在PCR重复项（0.1.18）³⁷。在RseQC和SAMtools mpileup的帮助下生成了覆盖率计算和轨迹。在组合中，50%的基因组在35倍或更多时被覆盖（99%在14倍或更多）。使用SAMtools mpileup+bcftools调用变量。生成的SNV列表经过高质量筛选，并由ANNOVAR进一步注释（2012年11月版本）³⁸使用Refseq基因注释。circos图是在circos软件（v0.63）的帮助下创建的³⁹。RNA-seq文库使用4μg千分之七RNA、RiboZero（Epicenter）和ScriptSeq v1（Epicentre）。在HiSeq2000上对库进行测序（50 bp单端读取）。使用Bowtie 2.0.0.6和ENSEMBL基因注释（加州大学圣克鲁斯基因组浏览器），1.13亿次读取与TopHat 2.0.3版一致。使用RSeQC包计算RPKM，不包括多次匹配读取。

除上述内容外BCR-ABL1型易位和潜在破坏性突变TP53型和槽口1(补充表3)，在KBM7细胞中未观察到髓系恶性肿瘤的复发异常，以及与癌症相关的主要基因，包括PTEN公司,KRAS公司,RB1型,BRAF公司和表皮生长因子受体没有携带突变。然而，配对RNA测序表明12号染色体上有一个小的反转，这已被Sanger测序证实(补充图8). 倒置破坏了两个基因(SRGAP1公司和PPM1H（PPM1H）)并生成一个新的、无特征的融合转录本。

质谱法

PBS洗涤的KBM7细胞颗粒与300μl 50 mM HEPES（pH 8.0）、2%十二烷基硫酸钠、1 mM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）混合，并在室温下培养20分钟。在99°C下将裂解液加热5分钟后，用Covaris声波仪（声波仪S2X，Covaris）对样品进行声波处理，并在16000℃下通过离心进行澄清克在室温下保持10分钟。蛋白质浓度采用BCA蛋白质测定法（皮尔斯生物技术公司）进行测量。用二硫苏糖醇还原二硫键后，根据辅助过滤样品制备（FASP）协议，用胰蛋白酶消化150μg总蛋白⁴⁰.通过固相萃取（SPE）浓缩和纯化50毫克消化液，并收集50个离线馏分⁴¹然后通过液相色谱分离肽，并在LTQ-Orbitrap-Velos混合质谱仪（Thermo Fisher Scientific）和安捷伦1200 HPLC纳米流系统（安捷伦生物技术）上通过碰撞诱导解离（CID）进行分析。使用搜索引擎MASCOT（v2.3.02，MatrixScience）和Phenyx（v2.5.14，GeneBio）对采集到的原始质谱（MS）数据文件进行处理，并根据人类SwissProt数据库进行搜索⁴²通过对反向数据库应用相同的程序，蛋白质和肽的假阳性检测率（FDR）分别为<1%和<0.1%。

我们观察到，KBM7细胞的蛋白质组与用于人类遗传学研究的其他11个先前具有特征的人类细胞系的蛋白质组有实质性的重叠（>50%）(补充表14)⁴³此外，细胞系之间KEGG通路的表达和覆盖显示出显著的一致性(补充图9). 因此，根据表达量高到可以通过质谱检测到的蛋白质判断，KBM7和几个流行的细胞系之间存在一致性。

基因捕捉突变克隆的生产和绘图管道

用于本研究的基因捕获盒的注释序列可在http://clones.haplogen.org/基因陷阱感染的KBM7细胞¹²经FACS分类用于GFP表达，并通过限制稀释进行克隆。

我们为每组6个96 well板生成正交克隆池（行、列和板），以跟踪它们的位置，条形码序列用索引引物进行PCR-扩增（即“池码”；图2c). 通过配对测序读取条形码和索引，从而为单个条形码（即克隆）唯一指定一个微孔和平板位置。这种正交池策略与索引测序相结合，可以明确识别约70%克隆的平板位置。在大多数情况下，未指定的板块位置是由于生长缓慢的克隆或空井造成的。由于每个板的位置都与单个条形码序列相关联，因此该程序也会标记包含多个克隆或多个基因标记整合的微孔，这两个微孔都会被丢弃。

为了绘制单个克隆的基因组插入位点，使用NlaIII和MseI并行消化相同池中的基因组DNA，并通过反向PCR进行处理¹²在第二次配对测序中匹配条形码和插入位点。相对较短的DNA序列标签和反向PCR中的强偏倚将常规作图效率限制在~85%。

使用QIAamp DNA迷你试剂盒（Qiagen）从细胞池中分离基因组DNA。使用GoTaq聚合酶（Promega）通过PCR扩增条形码。引物为Fwd:AATGATACGACCACCGAGATCTACACACAAACTCGTCAGTTCCACAC和Rev:CAAGCAGACGCATGAGATXXXXXXXXXXGTGACTGGAGTCAGACGTGTGT，其中X表示池特异性15 bp索引序列的碱基。

PCR产物被纯化并使用以下测序引物进行配对测序：第一读（池索引）：GATCGGAGAGCACACGTCTGACCAGTCAC和第二读（条形码）：GTGACTGGAGTCAGACGTGTCTTCCGATCT。每个条形码都链接到三个池代码，以指定行、列和唯一标识其在给定96-well板上位置的板。

为了将条形码与基因组插入位点联系起来，我们对576个克隆集（6个96 well板）进行了反向PCR，这些克隆集全部合并到一个池中。从细胞池中分离基因组DNA，并用NlaIII或MseI消化。将消化后的样品进行连接，并使用以下引物进行反向PCR：Fwd:AATGATACGGACCGAGATCTACATCTGATGTTCTAGCTTCC和Rev:CAAGCAGACGGCATACGGTGTACAAAAAGCGC。

使用以下测序引物对PCR产物进行配对测序：第一读（基因组）：CTAGCTTGCCAACTACAGGTGGTCTCTCA和第二读（条形码）：GTGACTGGAGTCAGACGTGTCTCTCT。

第一次读取确定基因陷阱的基因组整合位点，第二次读取确定22-bp条形码。因此，每个条形码都链接到单个基因组整合位点。我们估计，使用该平台生成、映射和分离单个突变克隆的成本在每个克隆200至400欧元（250至500美元）之间。预计成本会随着时间的推移而降低。

RT-PCR

为了测定mRNA的表达，我们分离出RNA并进行逆转录。根据制造商的说明，使用GoTaq聚合酶（Promega）通过PCR分析cDNA。为每个克隆定制PCR引物，以侧翼标记基因盒的插入位点。

选择性突变KBM7细胞的反向遗传分析

用TNF-α（Peprotech）细胞刺激的细胞在Frackelton缓冲液（10 mM Tris/HCl pH 7.5，50 mM NaCl，30 mM焦磷酸钠，1%Triton X-100，50 mM-NaF和蛋白酶抑制剂）中进行裂解，并使用IκB-α特异性抗体（C-21，稀释度1:500，Santa Cruz）进行蛋白质印迹分析和一种微管蛋白特异性抗体（ab-7291，稀释1:2000，Abcam）。为了诱导TNF-α介导的凋亡，用3μg/ml环己酰亚胺（Sigma-Aldrich）预处理细胞1 h，然后用30 ng/ml TNF-a刺激细胞24 h。用CellTiterGlo（Promega）评估细胞活力。

为了测量磷酸化-SMAD2（Ser465和Ser467，1:500，3108，细胞信号），将细胞血清饥饿过夜，并用10 ng/ml TGF-β（Peprotech）刺激。使用SMAD1/2/3（Santa Cruz sc-7960，1:1000）作为负载对照，通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。

为了评估对TRAIL的反应，用TRAIL（Peprotech）刺激细胞4小时，收获并裂解细胞（50 mM HEPES pH 7.4，250 mM NaCl，5 mM EDTA，1%NP40，50 mM NaF和蛋白酶抑制剂）。使用裂解的caspase-3（9661，Cell Signaling，1:1000）、RIP1（610458，BD Transduction Lab，1:1000，）和tubulin（7291，Abcam，1:1000。添加TRAIL后16 h，使用CellTiter-Glo（Promega）评估细胞活力。

细胞对干扰素-γ的反应是通过用100 ng/ml干扰素γ（肽基）刺激指定的时间段来测定的。细胞用冷PBS洗涤并在Frackelton缓冲液中溶解。使用磷酸-STAT1（Tyr701）特异性抗体（9171，稀释度1:1000，细胞信号传导）和微管蛋白特异性抗体（ab-7291，稀释度1:2000，Abcam）通过蛋白质印迹分析裂解物。

控制KBM7或ARID2公司用IFN-γ处理克隆24小时。然后用PBS清洗细胞，并使用RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen）提取RNA。国际单项体育联合会1使用KAPA SYBR FAST ABI Prism试剂盒（Peqlab）通过qRT-PCR测定表达水平。GAPDH公司以家政基因为对照。

为了进行微阵列分析，收集细胞并使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA。使用Primeview（Affymetrix）微阵列分析RNA，数据经过稳健的多阵列平均值（RMA）归一化。

我们感谢G.Winter和Brummelkamp、Nijman和Superti-Furga实验室成员的讨论和技术援助，感谢R.Martins在图2O.Majdic（维也纳医科大学）提供抗体，J.Carette提供基因陷阱载体设计建议，H.Pickersgill提供手稿编辑和建议。C.Banning获得了Zentrum für Innovation und Technologie（Die Technologieagentur der Stadt Wien）的FemPower赠款的支持，a.L.和M.L.获得了Zenterum fúr创新和技术生命科学2011赠款的支持。M.R.获得了欧洲分子生物学组织奖学金（ALTF1346-2011）的支持。K.P.得到了欧洲研究委员会的资助（ERC-2009-AdG-250179-i-FIVE）。