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.2013;8（3）：e59306。
doi:10.1371/journal.pone.0059306。 Epub 2013年3月13日。

Meckelin 3对Meckel综合征大鼠光感受器外节发育是必需的

萨里卡·蒂瓦里 1, 斯科特·哈德森, 文森特·H·盖通2号, 卡罗琳·米勒, 艾伦·A·G·切尔诺夫, 泰瑞·L·贝勒克-亚当斯
附属公司

Meckelin 3对Meckel综合征大鼠光感受器外节发育是必需的

萨里卡·蒂瓦里等。 公共科学图书馆一号. 2013.

摘要

脊椎病导致多器官病变，包括肾囊肿、耳聋、肥胖和视网膜变性。视网膜光感受器具有连接纤毛，纤毛连接内外节，负责运输分子以发展和维持外节过程。本研究通过免疫组织化学、细胞死亡分析和电子显微镜观察，评估了meckelin（MKS3）在外段发生过程中的表达，并确定了突变mekelin对Wistar多囊肾病Wpk/Wpk大鼠感光细胞发育和存活的影响。出生后第10天（P10）和第21天，MKS3在视网膜中普遍表达。然而，在成熟视网膜中，MKS3的表达仅限于感光细胞和视网膜神经节细胞层。在P10，野生型和纯合型Wpk突变视网膜都具有所有视网膜细胞类型。相反，通过P21，表达杆状和锥形特异性标记物的细胞数量较少，视蛋白的表达似乎异常局限于细胞体。细胞死亡分析与光感受器特异性标志物的消失一致，并表明细胞正在经历胱天蛋白酶依赖性细胞死亡。通过电子显微镜观察，P10感光细胞显示出带有轴丝的基本外节，但没有形成野生型感光细胞中明显存在的外节盘。在p21处，突变外段与P10突变外段几乎相同，只有一个短轴丝，而野生型对照组的外段发育有许多组织良好的椎间盘。我们的结论是，MKS3对于纤毛和基本外段的连接的形成并不重要，但对于外段过程的成熟至关重要。

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图1
图1。Meckelin 3在发育中的大鼠视网膜中。
用MKS3特异性抗体免疫标记的野生型P10（A）、P21（B）和成熟（C）视网膜切片的共焦成像显示，MKS3在出生后早期视网膜中广泛表达，在成熟视网膜中受到限制。（A） 在P10处，可以在ONL区域检测到MKS3，该区域与发育中的内外节段（箭头）以及内层和神经节细胞层一致。（B） 与P10相比，在P21，MKS3表现出类似的定位，但在此阶段外节的发育更为明显（箭头所示）。（C） 在光感受器外节和神经节细胞中检测到MKS3标记；在此阶段内核内未检测到标记物。视网膜切片也用MKS3（D，G，J）和微管蛋白（E）、ABCA4（H）或细胞色素C（K）双重标记，以更好地将MKS3蛋白定位在光感受器的内部和外部片段中。MKS3和微管蛋白（F）的重叠突显了MKS3在光感受器轴丝中的定位，该轴丝跨越内段、结缔纤毛和外段的下部。与MKS3在轴丝内的定位一致，在内段的上部与细胞色素C（L）有部分重叠。似乎与外节标记ABCA4（I）几乎没有重叠，表明MKS3主要定位于结缔组织纤毛和外节下部。在标记有MKS3和微管蛋白（M）、ABCA4（N）或细胞色素C（O）的切片上进行薄层共焦显微镜检查，以验证表达模式。对于M、N和O，xy平面被标记，黄色线表示右侧和底部条带中描述的x、z和y、z平面。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；OS，外段；细胞色素C；ABCA4，ATP-装订盒子家族A–成员4。比例尺：（A）bar = 面板A–C、（D）Bar为50µm = 面板D–L为50µm，面板m–O为100µm。
图2
图2。在杆和锥中发现MKS3。
使用MKS3（A，D）和杆状转导蛋白（B）或L/M视蛋白（E）特异性抗体对P21 WT视网膜切片进行双标记免疫组织化学。然后将共聚焦图像合并为单个图像（C，F），以显示MKS3和外节感光细胞的共同表达。插图（C，F）的放大倍数增加表明，MKS3在杆状转导蛋白和L/M视蛋白的定位中只有部分重叠。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；核外层ONL；OS，外段。比例尺：（A）50µm。
图3
图3。MKS3与IFT20部分共定位。
为了阐明哪些IFT蛋白可能与MKS3相互作用，我们对MKS3（A、D、G）和IFT88（B）、IFT20（E）和Cep290（H）进行了双标记免疫组化。共聚焦图像叠加（C，F，I）显示MKS3与IFT 20（F）部分共定位。MKS3未与IFT88（C）或Cep290（I）共同定位。定位数据通过薄层共焦显微镜（J–L）进行验证。在J–L中，x，y图像中的水平黄线表示面板底部x，z条带中所示的焦平面，x，y图像中的垂直黄线表示y，z面板中所示焦平面。比例尺 = （A） 面板A-I为50µm，面板J–L为（J）100µm。
图4
图4。MKS3突变中P10和P21之间光感受器缺失。
为了确定Mks3型P10和P21光感受器突变，切片免疫标记为视紫红质（A–D）、L/M视紫红蛋白（E–H）或S视紫红素（I–L）。在P10，在WT和突变视网膜（A，B）中很容易检测到数量相似的视紫红质标记细胞。在WT或突变视网膜（E、F和I、J）的P10处，L/M视蛋白和S视蛋白标记细胞均不丰富。到P21时，视紫红质在WT视网膜光感受器外段高度丰富，但存在于突变视网膜光感受器的细胞体中（C，D）。类似地，标记L/M视蛋白的外段很容易在WT感光细胞中检测到，但染色局限于突变感光细胞（G，H）的胞体。在WT光感受器外节中可检测到S视蛋白阳性细胞，但在突变视网膜中检测到极少数阳性细胞（箭头；K，L）。该部分的DAPI标签显示在每张图片右侧的一个小条带中，以指示视网膜细胞层（a–L）的位置。定量上，WT和P10（M）突变视网膜中CRX（+）细胞的数量非常相似。然而，与WT（N）相比，突变体视网膜基底部的杆数量大幅下降，L/M锥体数量减少，但具有统计学意义。GCL，神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；OS，外段；野生型；M、 突变体。**未配对t检验p>0.005。*非配对t检验p>0.05。比例尺：（A）50µm。
图5
图5。MKS3突变光感受器的细胞死亡。
通过TUNEL和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶标记P21 WT（A，C）和P21突变体（B，D）视网膜观察细胞死亡量。与WT相比，TUNEL和caspase 3标记显示P21突变大鼠视网膜外核层的细胞死亡表达丰富（箭头；B，D）。图中显示了每个视网膜细胞层（n）中TUNEL（E）和caspase 3（F）标记阳性的细胞计数 = 每个样品3个视网膜）。P10时TUNEL（+）细胞数量无显著差异；然而，在P21，TUNEL（+）细胞的数量在统计学上显著增加（p<0.005）。使用半胱天冬酶3，在P10和P21的WT、突变INL和GCL中未发现显著差异。然而，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3标记的细胞在实验组的ONL中显著增加Mks3型P10和P21的突变与WT的比较。（分别为p<0.01和0.001）。神经节细胞层；INL，内核层；ONL，外核层；OS，外段。比例尺：（A）50µm。
图6
图6。MKS3、IFT88、IFT20和Cep290在MKS3突变体中的定位。
对P10（A，C，E）和P21（B，D，F）MKS3突变视网膜切片进行MKS3和IFT88（A，B）、IFT20（C，D）或Cep290（E，F）的双重标记，并用薄层共聚焦显微镜进行分析。每个面板x，y图像中的水平黄线表示面板底部x，z条带中所示的焦平面，x，y图中的垂直黄线表示y，z面板中所示焦平面。所有面板中的蓝色标签为DAPI，以突出细胞核的定位。（A） 比例尺 = 100微米。
图7
图7。感光细胞外节的电子显微镜。
比较WT（A，C）和突变（B，D）视网膜P10和P21的电子显微镜图像。在P10，WT（A'，箭头）中可以发现新生的外节圆盘，而在突变株（B，箭头），外节不明显，但纤毛与无圆盘的膜环有关。WT P10中的线粒体呈细长结构，有可见的嵴（A’’），而突变视网膜中的线粒体肿胀，没有嵴（B’’）的迹象。在P21处，WT视网膜具有发育良好的OS和盘（C），而突变（D）显示纤毛延伸到OS空间，带有一些松散相关的膜物质，但未观察到盘（插图，D）。（A、C）IS；内部段，OS；外段，WT；野生型。比例尺 = 4µm，（B，D）2µm；A的插图 = 500 nm，B-D = 1微米。
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参考文献

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