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.2013年1月；2(1):68-80.
doi:10.5966/sctm.2012-0107。 Epub 2012年12月27日。

注射血管源性干细胞可预防扩张型心肌病，并促进杜氏肌营养不良mdx/utrn-/-但未衰老mdx小鼠模型的血管生成和内源性心脏干细胞增殖

朱兰春 1, 奥布莱恩, 闵浩松, Blake F Wondrasch公司, 苏珊娜·贝瑞
附属公司

注射血管源性干细胞可预防扩张型心肌病，并促进杜氏肌营养不良mdx/utrn-/-但未衰老mdx小鼠模型的血管生成和内源性心脏干细胞增殖

朱兰春等。 干细胞Transl Med. 2013年1月.

勘误表in

  • 干细胞移植医学，2013年2月；2（2）：以下158

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是肌营养不良最常见的形式。DMD患者缺乏肌营养不良蛋白，并出现骨骼肌病理和扩张型心肌病（DCM）。约20%死于心脏受累。我们假设，在DMD动物模型中，中成血管细胞干细胞（主动脉衍生中成血管干细胞[ADMs]）将恢复肌营养不良蛋白并减轻或预防DCM。ADMs可以诱导表达心脏标志物，包括Nkx2.5、心肌原肌球蛋白、心肌肌钙蛋白I和α-肌动蛋白，并采用心肌细胞形态学。根据超声心动图测量，在发育成DCM之前将ADM移植到mdx/utrn（-/-）小鼠的心脏中可以预防心肌病的发生，并导致CD31表达显著升高，与新血管形成一致。ADM注射心脏中检测到肌营养不良阳性心肌细胞和内源性Nestin（+）心肌干细胞增殖增加。在注射ADMs的五个mdx/utrn（-/-）心脏中，也有四个检测到Nestin（+）条纹细胞。相反，当ADMs注射到患有晚期纤维化的老年mdx小鼠的心脏时，超声心动图未检测到功能改善。相反，ADM加剧了DCM的一些特性。老年mdx心脏注射ADM后未检测到肌营养不良蛋白、CD31表达增加或Nestin（+）细胞增殖增加。然而，在将ADM移植到年轻mdx小鼠心脏后观察到肌萎缩蛋白，这表明老年mdx小鼠的心脏病理可能改变供体干细胞的命运。总之，在肌营养不良蛋白缺乏的心脏中，ADM延迟或阻止DCM的发展，但干细胞移植的时机可能对DMD心肌细胞治疗的益处至关重要。

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数字

图1。
图1。
ADMs采用心肌细胞样形态，体外表达心脏标志物。体外将ADMs分化为心肌细胞，并评估心肌特异性基因和蛋白的表达。（答：， B） ：生长介质中ADMs的形态（A）和心脏分化培养基（B）.（C，D）：分化培养基中的ADM在相邻细胞相遇的区域表达连接蛋白43（白色箭头）（C）并随着时间的推移慢慢采用心肌细胞形态（D）.（E） ：分化培养基中的ADMs表达心肌特异性mRNA，包括Nkx2.5、cTnI和cTm。心脏组织作为阳性对照，脂肪作为阴性对照。GAPDH被用作内部负荷控制。（F–L）：ADMs在分化培养基中表达心脏蛋白，包括心脏cTm（J），α-肌动蛋白（K）和cTnI（左）。原代大鼠心肌细胞被用作心脏蛋白的阳性对照（G–I）.（F） ：表达cTm的细胞的定量。蓝色输入（C、G–L）表示DAPI染色的细胞核。缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；CMGS，心肌细胞生长补充剂；cTm，心肌原肌球蛋白；cTnI，心肌肌钙蛋白I；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；DM，分化培养基；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GM，生长培养基；HS，马血清。
图2。
图2。
主动脉衍生间充质干细胞（ADM）标记、移植和心脏标记物表达。ADM被标记并移植到中密度纤维板并使用荧光显微镜检测移植后ADM中心脏特异性蛋白的表达。（答：， B） ：用pIRES2-AcGFP1稳定转染ADMs，并通过荧光激活细胞分选选择GFP表达强度。（C–F）：GFP转染的ADM（绿色【D、F】)涂上了DiI（红色[中、英])并在5周龄时注入心脏壁中密度纤维板老鼠。5周后，在心脏心室中检测到双标记GFP+DiI+细胞。（G–J）：DiI（红色，【H、I、K、L】)在表达心肌肌钙蛋白I蛋白（绿色）的细胞中检测到【G，I】)和肌营养不良蛋白（绿色【K，L】)在心室的心肌中。（J） ：仅与第二种FITC缀合的抗体一起孵育的组织。蓝色输入（E–J，L）表示DAPI染色的细胞核。缩写：cTpn I，心肌肌钙蛋白I；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；异硫氰酸荧光素；FSC，正向散射；绿色荧光蛋白。
图3。
图3。
ADM移植到mdx/utrn−/−心脏延迟扩张型心肌病的发病。控制和mdx/utrn（通用）−/−小鼠接受心内注射生理盐水或ADMs，并使用心脏超声测量心功能、心室大小和心壁厚度。（A–C）： mdx/utrn（通用）−/−对照组小鼠注射生理盐水（dko/HBSS；n个=4）LVPWd显著变薄（A），LVIDd增加（B）室间隔变薄（C）而年龄匹配的野生型小鼠（wt/HBSS；n个=4）和mdx/utrn（通用）−/−注射ADMs的小鼠（dko/ADMs；n个=5）没有。（D） ：EDV也大幅增加mdx/utrn（通用）−/−注射生理盐水的小鼠，但年龄匹配的野生型小鼠注射生理盐水或mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠。（A–D）：灰度条，预投影值；黑色条，注射后值。（E） ：注射ADMs或生理盐水时，不同治疗组小鼠的体重不同。（F） ：在最后一次心脏超声检查和随后的安乐死时，所有组小鼠的心重和体重比率没有差异。*，第页< .05. 缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；dko，双淘汰赛mdx/utrn（通用）−/−；舒张末期容积；HBSS，Hanks平衡盐水溶液；IVSd，舒张期室间隔；LVIDd，舒张时左室内径；LVPWd，舒张期左室后壁；wt，野生型。
图4。
图4。
肌营养不良蛋白表达和血管生成在mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠。用荧光显微镜分析野生型心脏中dystrophin和CD31的表达，mdx/utrn（通用）−/−、和中密度纤维板细胞移植或盐水注射后的小鼠。（答：， B） ：使用注射盐水的野生型对照小鼠作为肌营养不良蛋白表达（绿色）的阳性对照。（C， D） ：肌营养不良蛋白在心肌的一些细胞中检测到mdx/utrn（通用）−/−注射ADM后的小鼠(n个= 5).（E、， F） ：在中未检测到肌营养不良蛋白mdx/utrn（通用）−/−注射生理盐水的小鼠(n个= 4).（G， H） ：心肌中未检测到肌萎缩蛋白中密度纤维板注射ADM后的小鼠(n个= 4).（I–K）：CD31（绿色）是内皮细胞的标记物，通过免疫荧光显微镜检测并在所有组小鼠中定量。（A、C、E、， G） ：肌萎缩蛋白（绿色）。（B、D、F、， H） ：肌营养不良蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）的合并图像。（本人， J） 以下为：野生型对照心肌中CD31的代表性图像。（K） 以下为：CD31表达的定量分析显示CD31在mdx/utrn（通用）−/−心肌注射ADMs（dKO/ADMs；n个=5）比inmdx/utrn（通用）−/−心肌注射生理盐水（dKO/HBSS）；n个=4）或在年龄匹配的野生型小鼠中注射盐水（WT/HBSS；n个= 4). *, 统计显著差异(第页<.05）。缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；dKO，两次击倒mdx/utrn（通用）−/−；HBSS，Hanks平衡盐水溶液；WT，野生型。
图5。
图5。
移植的主动脉源性间充质干细胞（ADM）维持分裂细胞的基本水平mdx/utrn（通用）−/−心肌。分析Ki67的表达，以确定野生型和mdx/utrn（通用）−/−注射ADM或生理盐水的小鼠。用免疫荧光显微镜在注射盐水的野生型小鼠（WT/HBSS；n个= 4)（答：， B）,mdx/utrn（通用）−/−盐水注射小鼠（dKO/HBSS；n个= 4)（C， D）、和mdx/utrn（通用）−/−注射ADM的小鼠（dKO/ADMs，n个= 5)（E、， F）白色箭头表示Ki67+核（A–I、K、， L）与DAPI共同定位（B、D、F、I、， L）.（G–I）：注射生理盐水和Ki67的野生型小鼠心脏组织的高清晰度图像+细胞核（绿色【G】)与DAPI（蓝色【H，I】). Ki67阳性细胞在使用放大镜拍摄的图像中进行定量（G–I）.（J） ：sham注射组心肌中分裂细胞明显减少mdx/utrn（通用）−/−小鼠（灰色条）与年龄匹配的对照野生型小鼠（白色条）进行比较。然而，ADM注入mdx/utrn（通用）−/−心肌中分裂细胞（黑条）的数量明显高于注射盐的心肌mdx/utrn（通用）−/−心肌。ADM注射中分裂细胞的数量mdx/utrn（通用）−/−心脏与野生型心肌的基础水平没有显著差异。第页使用Student的t吨测试。使用神经干和祖细胞标记nestin的抗体来确定Ki67+分裂细胞表达nestin。（K， 五十） ：Ki67号机组+在表达nestin（红色）的细胞中检测到细胞核（绿色）。白色箭头表示嵌套+有核分裂细胞Ki67+表达式。黄色箭头表示巢穴+不增殖且不表达Ki67的细胞。（五十） ：来自的合并图像（K）使用DAPI。（B、D,F、 I、L）：Ki-67或Ki-67与巢穴的合并图像（左）使用DAPI（蓝色）。（J） ：*，所示组之间的统计学显著差异(第页< .05). 缩写：DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；dko，双淘汰赛mdx/utrn（通用）−/−；HBSS，Hanks平衡盐水溶液；WT，野生型。
图6。
图6。
内斯汀+ADM移植中的间质干细胞和心肌细胞mdx/utrn（通用）−/−心脏。用荧光显微镜观察巢蛋白+心脏的间质细胞和条纹细胞。（A） ：巢穴明显减少+注射ADM的间质干细胞（dko/ADMs，n个= 5)mdx/utrn（通用）−/−与年龄匹配的注射生理盐水的野生型心脏（WT/HBSS，n个= 4).第页使用Student的t吨测试。WT/HBSS与dKO/HBSS之间没有差异(第页=0.0538）或dKO/HBSS相对于dKO/ADM(第页= .3843).（B–F）：内斯汀+在五分之四的患者中观察到条纹细胞（绿色，用白色箭头表示）mdx/utrn（通用）−/−用ADMs移植的心脏。（C） ：一簇巢穴+条纹细胞（绿色，用白色箭头表示）和周围含有巢蛋白的组织+间质干细胞（也是绿色的，用黄色箭头表示）。（D–F）：相同的嵌套簇+单元格（绿色）如所示（C）高倍镜下，心肌肌钙蛋白I（红色[英， 【F】).（G） 以下为：一些巢穴+在四个样本中的一个样本中也观察到条纹细胞mdx/utrn（通用）−/−心脏注射生理盐水。（H） ：内斯汀+在盐水注射的野生型心脏中，纹状体细胞不存在。缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；cTpI，心肌肌钙蛋白I；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；dKO，双淘汰赛mdx/utrn（通用）−/−；HBSS，Hanks平衡盐水溶液；WT，野生型。
图7。
图7。
ADM移植到中密度纤维板心肌不能缓解扩张型心肌病的症状或促进血管生成、肌营养不良蛋白表达或巢蛋白正常化+细胞分裂。心脏超声用于评估野生型或mdx公司用ADMs或生理盐水移植的小鼠。（A） ：两组患者均观察到显著的心室扩张中密度纤维板注射细胞或生理盐水的小鼠与注射假（生理盐水）的野生型小鼠的比较(n个= 3).中密度纤维板与注射前值相比，注射ADMs的小鼠在注射干细胞后心室扩张也显著增加（注射后栏上用星号表示）。（B） ： 中密度纤维板注射盐水的小鼠(n个=4）注射前后左室壁显著变薄，而中密度纤维板注射ADM的小鼠(n个=4）表明注射前后心室壁厚度显著增加。ADM移植后心室壁厚度的增加中密度纤维板小鼠显著高于野生型和中密度纤维板假注射小鼠。（C， D） ： 中密度纤维板通过EF测定，接受假药物或ADMs的小鼠在注射后心脏功能显著下降（C）和FS（D）.（E） ：EDV在中密度纤维板ADM移植后的小鼠。免疫荧光显微镜用于评估野生型或中密度纤维板注射生理盐水或ADM的小鼠。（F） ：胶原蛋白免疫荧光染色定量分析，老年人胶原蛋白含量显著增加中密度纤维板心脏与年龄匹配的野生型小鼠心脏的比较。（G） ：对照组和ADM注射组小鼠心肌中CD31的表达无差异。（H） 以下为：在中密度纤维板与年龄匹配的野生型心肌相比，ADM注射对这一数字没有影响。（A–E）：灰色条，注射前值；黑条，注射后超声值。（F–H）：白条，注射盐水的野生型小鼠；灰色条，中密度纤维板小鼠注射生理盐水；黑色条，中密度纤维板注射ADM的小鼠。WT/H：注射生理盐水的野生型小鼠(n个= 3); 中密度/高：中密度纤维板盐水注射小鼠(n个= 4); mdx/ADM：中密度纤维板注射ADM的小鼠(n个= 4). *, 显著差异(第页<.05）。（注射后条上的星号表示一组小鼠注射前和注射后值之间存在显著差异，而两组小鼠之间的显著差异由两组之间的线条和星号表示。）缩写：ADM，主动脉源性中成血管细胞；舒张末期容积；EF，射血分数；FS，分数缩短；H、 盐水注射；LVIDd，舒张时左室内径；LVPWd，舒张期左室后壁；wt，野生型。
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