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.2013年1月；27(1):74-91.
doi:10.1210/me.2012-1182。 Epub 2012年12月4日。

GATA2诱导的沉默和LIM-homeodomain蛋白诱导的激活由大鼠GnRH受体基因中的双功能反应元件介导

Anne-Laure Schang公司 1, 安妮·格兰杰, 布鲁诺·奎拉特, 克里斯蒂安·布鲁, 乔尔·科恩·塔努吉, 珍妮·诺埃尔·拉韦里埃
附属公司

GATA2诱导的沉默和LIM-homeodomain蛋白诱导的激活由大鼠GnRH受体基因中的双功能反应元件介导

Anne-Laure Schang公司等。 分子内分泌学. 2013年1月.

摘要

GATA2转录因子、LIM同源域蛋白Islet1（ISL1）和LIM同源盒3（LHX3）被怀疑与促性腺激素细胞的命运和维持有关。GnRH受体基因（Gnrhr）对促性腺激素功能至关重要，从胚胎第13.5天起，早于LH和FSHβ亚基在垂体中表达。这种表达模式以及Gnrhr启动子序列中存在的WGATAR和TAAT基序表明早期转录因子参与启动子激活。在这项研究中，使用一个表征良好的转基因小鼠模型，发现GATA2与垂体中的Gnrhr启动子活性共定位。Gnrhr启动子荧光素酶融合构建物与GATA2表达载体或促性腺激素细胞系中的小干扰RNA瞬时转染表明，GATA2作为一种典型的反激活剂，意外地抑制了Gnrhr启动子的活性。利用DNA色谱亲和性和EMSA，我们证明GATA2通过包含特殊回文GATA基序的响应元件进行操作，该基序与LHX3/ISL1反激活涉及的关键TAAT基序重叠。事实上，尽管GATA2具有抑制作用，但该元素在促性腺激素细胞中显示出明显的增强活性。染色质免疫沉淀分析表明，GATA2、LHX3和ISL1与包含该元件的Gnrhr启动子片段相互作用。GATA2对Gnrhr启动子活性的反抑制作用可能被LIM同源域蛋白通过这种新型双功能LIM/GATA反应元件的反激活作用所平衡，甚至受到阻碍。这种层次性的相互作用可能有助于在垂体发育期间以及成年动物的促性腺激素细胞系中微调Gnrhr基因的表达。

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数字

图1。
图1。
1.1 kb大鼠的示意图格纳尔发起人。这张示意图说明了我们之前研究中所描述的反应元件和相关转录因子的位置。启动子包含两个调控域。活性近端结构域（−475/−32）包含四个与AP1、SAP（尚未表征的因子）、SF1和CREB相互作用的响应元件。远端增强子（−1135/−753）包含一个定位于−873/−852之间的近端LIM-HD反应元件，该元件被LIM-HD蛋白、LHX3和ISL1的异二聚体激活。EMSA中功能性远端元件与GATA相关因子结合。
图2。
图2。
转录因子GATA2在促性腺激素细胞核中检测到，且大多与格纳尔启动子活性。A、 GATA2转录因子在垂体前叶细胞的细胞核中检测到格纳尔启动子活性。从转基因成年雄性小鼠[Tg(促性腺激素受体碱性磷酸酶)1Jnl]并按中所述进行处理材料和方法用免疫组织化学法同时检测GATA2因子，格纳尔启动子活性通过ALPP检测，细胞核通过DAPI染色。正如预期的那样，在抗GATA2抗体免疫染色后，只有有限数量的细胞核出现荧光(顶部面板,白色箭头、和箭头)，大多数仍然是负面的(顶部面板,空箭头). 大多数表达GATA2的细胞也显示ALPP活性(白色箭头). 一些不表达GATA2的细胞仍然表达ALPP公司(空箭头). 相反，一些GATA2阳性的细胞对ALPP公司表达式(白色箭头). B、 永生化促性腺激素细胞系中GATA2的检测。GATA2在αT3-1和LβT2细胞系中均表达。顶部面板，使用抗GATA2抗体进行免疫组织化学检测。下部面板、GATA2的Western blot鉴定和定量。无论采用何种方法，LβT2细胞中GATA2的含量明显高于αT3-1细胞。
图3。
图3。
GATA2抑制格纳尔促性腺激素细胞系中的启动子活性。A、 GATA2和GATA3抑制格纳尔共转染实验中的启动子活性。包含1.1（−1135/−32）或3.3（−3254/−32kb）-kb的荧光素酶启动子融合构建物格纳尔启动子（pLuc1.1促性腺激素释放激素受体或pLuc3.3格纳尔)与表达GATA2、GATA3、GATA4和GATA6的载体或空pcDNA3载体（对照）一起瞬时转染αT3-1和LβT2细胞。48小时后测量荧光素酶活性，如材料和方法并表示为对照启动子活性的百分比。GATA2和3显著抑制格纳尔无论启动子大小，αT3-1细胞中的启动子活性。在LβT2细胞中，尽管观察到类似的模式，但只有3.3-kb启动子被显著抑制。结果为平均值±标准偏差在一式三份进行的至少三个独立实验中。***，P（P）< 0.001; **P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05. B、 GATA2 siRNA刺激格纳尔启动子活性。左侧面板，最小催乳素基因(Prl公司)仅启动子(Prl最小值将pGL3载体中荧光素酶报告基因上游的四个GATA反应元件（GATA RE 4X）与对照或GATA2 siRNA瞬时转染到LβT2细胞中。右侧面板，荧光素酶启动子融合构建物包含0.44-（−475/−32）、1.1-或3.3-kb格纳尔启动子与对照或GATA2 siRNA一起瞬时转染到LβT2细胞中。pLuc3.3的显著刺激格纳尔GATA2 siRNA诱导活性。含有1.1-kb启动子的构建物也受到显著刺激，尽管程度较低。pLuc0.44的活性格纳尔构造未被调制。转染后40 h测量荧光素酶活性，如材料和方法结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05. C、 GATA2 siRNA可降低GATA2蛋白水平。在相同条件下，通过放大转染，在12孔板上进行了平行实验。所示数据代表两个独立的重复实验。
图4。
图4。
−994/−960区域内的GATA基序介导GATA2对格纳尔发起人。A、 GATA2诱导−994/−960的消音器活动格纳尔启动子区。将−994/−960区域的四个副本插入最小格纳尔pGL3载体中荧光素酶基因的启动子导向表达。最小值格纳尔启动子（称为最小启动子）包含与−136/−32相关联的−275/−226 SAP/SF1模块格纳尔包含转录起始位点的核心启动子。这种构造或最小格纳尔然后用pcDNA3空载体瞬时共转染启动子(黑色条)或使用GATA2表达载体(白色条)转化为CHO细胞。转染后40 h测量相对荧光素酶活性，如材料和方法结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）>0.05之间。B、 包含GATA基序的10bp序列的突变消除了GATA2的抑制作用。野生型pLuc1.1格纳尔或者将−971/−962和−959/−950突变的对应物与pcDNA3空载体瞬时共转染(黑色条)或GATA2表达载体(白色条)转化为αT3-1细胞。−971/−962序列的突变专门消除了GATA2的抑制作用，但也显著降低了启动子活性。结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）> 0.05.
图5。
图5。
−994/−960区域是一个双功能元件，传递消音器和增强器特性。A、 −994/−960区域内活性基序的突变诱导启动子活性的激活或抑制。与−994/−960启动子序列对应并携带指示突变的双序列寡核苷酸(装箱的/颠倒的)在潜在的活性基序中设计、合成并融合到一个最小的启动子，将荧光素酶基因的表达导向pGL3载体。此处最小启动子由与−35/+35核心相关联的−275/−226 SAP/SF1模块组成Prl公司发起人。如图3图例所示，通过瞬时转染αT3-1细胞来评估单个和组合突变的效率。B、 −994/−960序列的多重化导致启动子活性成比例增加。在三个TAAT基序（mut1-2-3）上突变的−994/−960区域或其对应区域被多重聚合并插入最小基序上游5′处格纳尔启动子（见图4A）进入pGL3载体。如图3所示，通过在αT3-1细胞中瞬时转染对每个序列包含一到八个拷贝的构建物进行测试。结果为平均值±标准偏差在一式三份进行的至少三个独立实验中。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）>0.05之间。C、 EMSA数据分析概述了与功能活性基序相对应的三种特定复合物。对αT3-1核提取物（NE）进行EMSA，如材料和方法。除另有说明外，所有竞争性寡核苷酸（序列见图5A）的使用量为500倍。SC显示为箭头从竞争实验中推断并指出了每个复合物中涉及的相应DNA模体。
图6。
图6。
与GATA2相比，LIM-HD蛋白LHX3和ISL1刺激−994/−960区域的启动子活性。A、 LHX3和ISL1刺激−994/−960区域的启动子活性。含有−994/−960区多聚体或在三个TAAT基序（mut1-2-3）上突变的等效序列的萤光素酶构建体（见图5A）与LHX3和ISL1表达载体共转染(黑色条)或等量的pcDNA3空向量(白色条)转化为CHO细胞。转染后40 h测量相对荧光素酶活性，如材料和方法结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。B、 LHX3的显性-阴性形式抑制−994/−960区域的启动子活性。将含有多重聚合−994/−960序列的所示荧光素酶构建物与LHX3、KRAB-LHX3或等量的空pcDNA3载体（对照）在αT3-1细胞中共转染。结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。C、 增加GATA2剂量逐渐降低LHX3/ISL1诱导的刺激。在CHO细胞中以固定浓度的LHX3和ISL1表达载体（每孔10 ng）和增加GATA2表达载体浓度（每孔2.5到20 ng）共同转染含有在三个TAAT基序（D-LIREmut 4X）上突变的四个D-LIRE（D-LIRE 4X）或D-LIRE拷贝的荧光素酶构建物。如图所示，通过添加pcDNA3使含有载体的巨细胞病毒启动子的总浓度（40 ng/孔）保持恒定。结果为平均值±标准偏差一式三份进行的三个独立实验。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）> 0.05.
图7。
图7。
小鼠启动子通过相当于大鼠启动子−994/−960区域的元素招募GATA2和LIM-HD蛋白。A、 大鼠和小鼠LIM-HD和GATA反应元件的结构保守性格纳尔发起人。使用欧洲生物信息研究所提供的ClustalW2程序对大鼠和小鼠启动子序列进行比对(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). 两个启动子的编号都始于ATG翻译起始密码子，腺嘌呤被认为位于+1位。P-LIRE位于小鼠启动子的近端，反义链（−）位于−342/−363，而大鼠启动子的相应序列位于感义链（+）的远端，位于−852/-873。相反，被称为D-LIRE的−994/−960区域位于小鼠（−927/−961）和大鼠启动子的远端位置。B、 小鼠D-LIRE比同等的大鼠启动子序列具有更高的增强子活性。通过瞬时转染αT3-1细胞，比较大鼠和小鼠D-LIRE序列的增强子活性。大鼠D-LIRE的5′序列，特别是TAAT 1赋予消音器特性。这部分序列在小鼠D-LIRE中略有不同，在5′端有三个8 bp的错配。因此，这可以解释其更大的增强子性质。C、 P-LIRE附近TSS和D-LIRE处的ChIP。利用针对三甲基组蛋白H3赖氨酸4（atriMeK4）、三甲基组分H3 lys 27（atriMeK27）、磷酸化聚合酶2（aPol-II）、LHX3、ISL1、ISL2、GATA2和GATA3的抗体，从免疫沉淀的LβT2染色质中纯化DNA，对P-LIRE和D-LIRE区域进行PCR扩增。用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶和实时PCR进行半定量PCR分析(黑条)按照中所述进行材料和方法“No AB”对应于在没有抗体的情况下获得的信号，用作阴性对照。将从非免疫沉淀染色质（输入样品）中纯化的DNA稀释20倍，进行PCR并用作阳性对照。
图8。
图8。
GATA2和LIM-HD蛋白与−994/−960区域（D-LIRE）相互作用，并在成人垂体内共定位。A、 DNA亲和层析显示GATA2和LIM-HD蛋白与−994/−960区域（D-LIRE）结合。通过将αT3-1或LβT2核提取物与链霉亲和素磁珠相连的生物素化DNA序列孵育来评估结合特异性。D-LIRE探针包含与包含SF1元素的−260/−237区域的一个副本相关联的−994/−960区域的八个副本。MUT探针是相同的，只是每个−994/−960区域拷贝上的三个TAAT基序都发生了突变。钴探针含有8个不含SF1元件的−260/−246启动子区拷贝，用作阴性对照。将与探针特异结合的蛋白质洗脱（洗脱液）并与未结合的蛋白质（上清液）一起在12%SDS-PAGE上进行解析，并使用所示的抗LHX3、抗SF1、抗EGR1、抗ISL1和抗GATA2抗体通过Western blot进行分析。B、 GATA共识调查是SC2的高效竞争对手。EMSA分析如图5C所示。竞争实验中使用了特定的ISL1和GATA共识探针。与具有50倍过量的GATA共有探针的相同复合物的有效位移相比，在存在500倍过量的ISL1共有探针的情况下观察到SC2的轻微位移。C、 ISL1和GATA2的Colocalization with格纳尔成人垂体中的启动子活性。2个月大转基因雄性小鼠的大脑[Tg(Gnrhr-ALPP公司)1Jnl]按照材料和方法.ALPP活动反映格纳尔启动子活性如材料和方法使用ISL1和GATA2抗体进行免疫组化。DAPI被用作副染色剂。ALPP活性和ISL1和GATA2免疫反应在这里显示为假白色,红色、和绿色颜色。表达ALPP和ISL1的细胞示例(白色箭头)、ALPP、GATA2和ISL1(白色箭头)，或仅ALPP(空箭头)如图所示。比例尺，100微米。
图9。
图9。
描绘GATA2作为抑制因子的假设作用的示意图促性腺激素释放激素受体非促性腺激素细胞和促性腺细胞中的基因表达。在LHX3和ISL1（非促性腺激素细胞）均缺失的情况下，GATA2可能参与格纳尔通过与普遍存在的GATA-依赖性阻遏物相互作用，该阻遏物结合D-LIRE的5′部分，包括第一个TAAT。在LHX3和ISL1存在的情况下，启动子可能被激活或抑制，这取决于GATA2和LIM-HD蛋白的各自水平。通过使用GATA2表达载体（过表达）或针对GATA2的siRNA的瞬时转染实验证明了这一点。
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