大鼠GnRH受体基因中的双功能反应元件介导GATA2诱导的沉默和LIM-内啡肽蛋白诱导的激活

抗体

兔抗LXH3多克隆抗体（AB3202）购自Chemicon International（Temecula，CA）；来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）的兔多克隆抗早期生长反应蛋白1（EGR1）（sc-110）、抗GATA2（sc-9008）和小鼠单克隆抗GATA3（sc-268）抗体；来自Abcam（英国剑桥）的组蛋白H3（三甲基-K4）抗体（ab8580，ChIP等级）、组蛋白H4（三甲基-K27）抗体（ab6002，ChIP级别）和RNA聚合酶II（Pol-II）CTD重复序列YSPTSPS（磷酸-S5）抗体（ab 5131，ChIP级）；以及来自Upstate Biotechnology（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）的兔抗SF1多克隆抗体。Thomas M.Jessell和Susan Brenner-Morton开发的单克隆抗鼠ISL1抗体（394D5）和单克隆抗ISL2抗体（514H9）是从由尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所[b]，由爱荷华州爱荷华市爱荷华大学生物系管理。

细胞培养和质粒构建

由P.Mellon博士（加利福尼亚大学拉荷亚分校）慷慨提供的小鼠促性腺激素αT3-1和LβT2细胞，以及中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，使用添加10%胎牛血清和50μg/ml庆大霉素的高糖DMEM在37℃的湿化5%CO中进行单层培养₂-95%空气。这个格纳尔先前描述了启动子荧光素酶融合结构，并将其与ATG翻译起始密码子的A相对编号为+1(7,11,12). 简单地说，pLuc3.3格纳尔，pLuc1.1格纳尔和pLuc0.44格纳尔构建物由插入大鼠5′上游序列的−3254/−32、−1135/−31和−475/−2片段而产生格纳尔将启动子导入包含萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3基本载体（Promega，Madison，WI）。启动子片段包括前面描述的转录起始位点和顺式-αT3-1和LβT2促性腺激素细胞系中的活性元素。−971/−962和−959/−950 pLuc1.1格纳尔-前面已经描述了变异的结构(11). 如前所述，对GATA-RE、远端LIRE（D-LIRE）和D-LIREmut1-2-3序列进行定向多重聚合(12) (表1). 将多重化序列插入pGL3载体上游的格纳尔引导荧光素酶表达的启动子。该最小启动子包含−275/−226模块，其中包括SF1响应元件（−245/−237）和−136/−32模块，其中包含CREB响应元件（-110/−103）和转录起始位点。ISL1的表达载体编码来自Gilles Salbert博士（法国雷恩第一雷恩大学），LHX3和KRAB-LHX3的编码来自Simon Rhodes教授（印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院），GATA4和GATA6的编码来自Robert Viger博士（加拿大魁北克市拉瓦尔大学），GAGA2和GATA3的编码来自Dr。佐佐木茂和（日本滨松市滨松大学医学院）。

转染分析和短干扰RNA（siRNA）干扰

针对加塔2设计了mRNA，并由Invitrogen（英国佩斯利）合成了三种双链隐形RNA及其各自的对照物。其中一个靶向序列5′-CGGGCACUGUGUUGCAAAUGUCA-3′，位于加塔2mRNA（国家生物技术信息中心参考序列｛“类型”：“entrez核苷酸”，“属性”：｛“文本”：“NM_008090.4”，“term_id”：“142378318”，“term_text”：“NM_008090.4”｝NM_008090.4号)因其效率而被选中，并与相应的对照siRNA（5′-CGUCGAGUAGCUGUAGCGUCA-3′）一起用于siRNA干扰分析。对于瞬时转染分析，大鼠格纳尔启动子荧光素酶融合构建物（100 ng/孔）与pRL-SV或pRL-TK（5至10 ng/孔米)，与0.5μl LipofectAMINE2000试剂（马里兰州盖瑟斯堡生命科技公司）在10μl OptiMEM-1中混合30分钟。然后将转染混合物添加到2×10⁴在96-well板上电镀之前，将电池放入40μl OptiMEM-1中。培养细胞4-6小时，然后添加50μl DMEM，补充4%胎牛血清和10μg/ml庆大霉素或10 U/ml青霉素和10μ/ml链霉素。细胞再培养36小时，然后收获以评估萤火虫和雷尼利亚荧光素酶活性（Promega）。

核提取物和EMSA

如前所述，从细胞中制备核提取物并用于EMSA(11). 简单地说，双链大鼠和小鼠寡核苷酸被设计成包含5′-突起末端。然后用Klenow片段填充凹陷的3′末端，标记它们（2.5 pmol）大肠杆菌使用50μCiα的DNA聚合酶I[³²P] dCTP（3000 Ci/mmol；Amersham Pharmacia Biotech，Les Ulis，France），并通过Sephadex G50细柱纯化。核提取物（10μg）和聚脱氧核苷（1μg）在结合缓冲液中孵育[20m米HEPES（pH 7.9），60米米KCl，60米米氯化钠，1米米EDTA、300 mg/ml BSA和12%（vol/vol）甘油]在4 C下持续15分钟。然后添加20000–50000 cpm的寡核苷酸探针（～5 fmol），添加或不添加过量的未标记寡核苷酸，并在20 C下持续培养30分钟。在三硼酸-EDTA缓冲液中的5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上解析蛋白质-DNA复合物。然后将凝胶干燥并进行放射自显影。

DNA亲和纯化

如前所述进行DNA亲和纯化(12)，稍作修改。简而言之，−994/−960区域（D-LIRE）、其TAAT突变对应物（D-LIREmut1-2-3）和对应于SF1邻近蛋白（SAP）的−260/−244区域的八个拷贝元素和用作阴性对照，使用正义引物和反义生物素化引物扩增，使用包含多聚序列的质粒DNA基质，并结合到磁性链霉亲和素珠（Dynabeads M-280链霉亲和素；Invitrogen，Dynal，Oslo，Norway）。对于每个序列，150μg活化珠与675μgαT3-1或LβT2核提取物在室温下孵育30 min并旋转。将聚脱氧核糖核酸（Poly，deoxyinosine-deoxycytosine）作为非特异性竞争物添加到结合反应中。然后洗涤珠粒，并在30μl中在室温下旋转洗脱结合蛋白15分钟。使用1.5μl（5%）或3μl（10%）洗脱液以及33.75μg（5%）未处理的核提取物，通过Western blot分析洗脱样品。

蛋白质提取物和蛋白质印迹

从αT3-1和LβT2细胞中制备总蛋白提取物。25cm处汇合细胞²用PBS冲洗培养瓶两次，刮除、收获并离心，所得颗粒在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中溶解。将裂解物在注射器中通过10次，在4℃下孵育1小时，并在4℃下以10000×克如前所述，通过Western blot分析上清液（15μg）中的蛋白质(26)使用1:200稀释度的针对GATA2的一级抗体，以及1:5000稀释度的第二种山羊抗兔IgG过氧化物酶。使用分别以1:3000、1:1500、1:2000和1:400稀释的针对LHX3、ISL1、SF1或EGR1的一级抗体和结合辣根过氧化物酶的二级抗体兔抗鼠IgG（DAKO，Glostrup，丹麦）分析DNA亲和纯化洗脱液样品或分别以1:4000和1:7000稀释的山羊抗兔IgG过氧化物酶。使用增强化学发光系统观察免疫复合物（法国萨克利Amersham Biosciences）。

免疫细胞化学和组织化学

将αT3-1和LβT2细胞放置在八个玻片室中。在50%的汇合处，用PBS冲洗细胞，并在4 C的甲醇中固定10分钟。两个细胞系都接受完全相同的实验程序和暴露时间（400毫秒）。3.3 kb纯合雄性转基因小鼠Gnrhr-ALPP公司[吨(Gnrhr-ALPP公司)1Jnl]如前所述进行分析(12,23). 大脑固定在4%多聚甲醛中。用PBS清洗两次后，将组织样品分别在4℃下的PBS中的12、15和18%蔗糖中培养24小时，然后在−60℃下冷冻。将16个微米的大脑冷冻切片安装在载玻片上，在65℃下加热以抑制内源性磷酸酶，并在适当的缓冲液中与含有硝基蓝四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸的显色酶底物混合物孵育，以揭示耐热的人类ALPP。分别以1:50和1:500稀释液用针对GATA2或ISL1的抗体进行免疫染色。最终揭示是用Alexa-488和Alexa-568结合的二级抗体以1:1000的稀释度进行的。为了显示细胞核，采用4′，顺-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色作为副染色。

染色质免疫沉淀

ChIP基本上是按照Abcam X-ChIP协议中的描述执行的，只做了少量修改。简而言之，细胞与甲醛交联。为了制备细胞核，将来自100mm培养皿的细胞刮入含有10ml缓冲液的10ml缓冲液中米HEPES（pH 7.9），10 m米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米EGTA，0.25%Triton X-100，在冰上培养10分钟，在500×克将细胞核重新悬浮在含有10 m的20 ml缓冲液中米HEPES（pH 7.9），200 m米氯化钠，1米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米EGTA和0.01%Triton X-100，孵育10分钟，并如上离心。将核芯块重悬于1ml ChIP裂解缓冲液中，并在90%的设定下超声处理四次25秒（配备微型探测器的Vibra Cell超声仪，Sonics and Materials，Newtown，CT）。后续步骤如X-ChIP协议（Abcam）所述，但两个额外的250 m清洗步骤除外米氯化锂和其他两个10m米Tris（HCl）（pH 8.0）和1 m米进行EDTA（pH 8.0）。所有清洗均使用微生物旋转柱进行（英国Hemel Hempstead的Bio-Rad实验室）。

实时PCR

如前所述进行实时PCR(27)使用每个ChIP的1μl（2%）洗脱液（12μl最终体积）和1μl 0.1×稀释输入。通过以下计算计算比率：R（%_输入) = 2^{[（Cp输入-Cp洗脱液）×1/2效率]}，每个引物对的标准曲线衍生效率来自LightCycler 480软件（Roche Diagnostics）。

GATA2抑制大鼠格纳尔促性腺激素细胞的启动子活性

确定GATA2是否监管格纳尔启动子活性、αT3-1和LβT2细胞与含有荧光素酶报告基因的构建物共转染格纳尔启动子从−1135延伸到−32（pLuc1.1格纳尔)或从−3254到−32（pLuc3.3格纳尔)以及编码GATA2、GATA3、GATA4或GATA6的表达载体(图3A） ●●●●。正如预期的那样，这些表达载体能够刺激荧光素酶报告基因，该基因由位于最小GATA反应元件上游的四个共有GATA反应元件驱动Prl公司启动子[pLucGATA-RE（4X），参见补充图2]。相反，两者都是格纳尔启动子结构在αT3-1细胞中被GATA2显著抑制(图3A、，左侧面板). 在LβT2细胞中也观察到抑制作用，尽管程度较小，可能是由于内源性GATA2水平较高(图2B） ●●●●。在其他GATA因子中，只有与GATA2密切相关的GATA3能够模拟GATA2抑制作用，与GATA3在垂体GATA2基因敲除小鼠中的假定补偿作用一致(19). 这一出乎意料的结果促使我们评估了LβT2细胞的启动子活性，其中内源性GATA2表达被针对小鼠GATA2 mRNA的siRNA抑制Prl公司预期启动子不受抗GATA2 siRNA的影响，而GATA-RE 4X受到显著抑制(图3B、，左侧面板).

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图3。

GATA2抑制格纳尔促性腺激素细胞系中的启动子活性。A、 GATA2和GATA3抑制格纳尔共转染实验中的启动子活性。包含1.1（−1135/−32）或3.3（−3254/−32kb）-kb的荧光素酶启动子融合构建物格纳尔启动子（pLuc1.1格纳尔或pLuc3.3格纳尔)与表达GATA2、GATA3、GATA4和GATA6的载体或空pcDNA3载体（对照）一起瞬时转染αT3-1和LβT2细胞。48小时后测量荧光素酶活性，如材料和方法并表示为对照启动子活性的百分比。GATA2和3显著抑制格纳尔无论启动子大小，αT3-1细胞中的启动子活性。在LβT2细胞中，尽管观察到类似的模式，但只有3.3-kb启动子被显著抑制。结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05. B、 GATA2 siRNA刺激格纳尔启动子活性。左侧面板，最小催乳素基因(Prl公司)仅启动子(Prl最小值−35/+35）或与pGL3载体中荧光素酶报告基因上游的四个GATA反应元件（GATA RE 4X）融合，与对照或GATA2 siRNA一起瞬时转染到LβT2细胞中。与对照siRNA相比，GATA2 siRNA显著抑制GATA RE 4X报告基因的活性。右侧面板，荧光素酶启动子融合构建物包含0.44-（−475/−32）、1.1-或3.3-kb格纳尔启动子与对照或GATA2 siRNA一起瞬时转染到LβT2细胞中格纳尔GATA2 siRNA诱导活性。含有1.1-kb启动子的构建物也受到显著刺激，尽管程度较低。pLuc0.44的活性格纳尔构造未被调制。转染后40 h测量荧光素酶活性，如材料和方法结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; *,P（P）< 0.05. C、 GATA2 siRNA降低了GATA2蛋白水平。在相同条件下，通过放大转染，在12孔板中进行平行实验。所示数据代表两个独立的重复实验。

关于格纳尔启动子，最短的结构，包含从−475延伸到−32的非常近的调控域（pLuc0.44格纳尔)当抗GATA2 siRNA同时表达时，1.1kb和3.3kb启动子明显被激活(图3B、，右侧面板)，证实GATA2对格纳尔启动子活性。该实验进一步表明，位于−475和−32 bp之间的启动子区域对GATA2无反应，这与该序列中缺少WGATAR基序一致。在平行实验中进行的Western blot分析表明，在LβT2细胞中，GATA2蛋白水平显著降低了60%-加塔2siRNA，与GATA2水平和格纳尔启动子活性(图3C） ●●●●。内源性格纳尔在这些平行实验中还评估了mRNA水平。未观察到显著影响（未说明）。然而，内源性mRNA的转染效率和半衰期可能会大大削弱siRNA诱导的敲除。

使用含大鼠荧光素酶构建物的进一步瞬时转染实验Lhb（磅）（−648至+4）和大鼠Cga公司（−1188至+46）启动子被执行。结果表明，大鼠低血红蛋白和Cga公司与1.1-kb相比，与抗GATA2 siRNA共转染对启动子没有显著调节格纳尔启动子（补充图3）。GATA2的压制作用将限于格纳尔发起人。

WGATAR基序的缺失，特别是大鼠启动子远端区域内GATA重复序列的缺失导致启动子活性增加

3.3-kb大鼠启动子包含一个GATA重复序列，该重复序列由13个GATA基序组成，位于−1446和−1393之间的从头到尾方向，以及在从−2391到−1445的区域中的另外三个WGATAR基序。包含这16个GATA基序的1000bp区域的缺失导致αT3-1和LβT2细胞中启动子活性的显著增加（约3倍）（补充图4），支持GATA重复序列可能充当消音器的假设。然而，由于这种特殊的、远距离的GATA重复序列是在大鼠体内特异性发现的，而不是在小鼠或人类启动子中，因此对该区域的研究没有进一步发展。相反，1-kb大鼠近端启动子与其小鼠和人类对应物显示出显著的序列一致性，因此进行了仔细检查。

的−994/−960区域格纳尔启动子被GATA2抑制

1.1-kb启动子对GATA2有反应，如图图3，很可能通过位于位置−966/−961的GATA响应要素TGATA约束GATA相关因素(11) (图1). 为了评估此基序是否可能赋予GATA响应性，将包含GATA基序的−994/−960区域的四个拷贝放在最小值的上游格纳尔pGL3载体中的启动子，并在中性CHO细胞系中通过瞬时转染进行分析。正如预期的那样，共同转染GATA2表达载体导致（−994/−960）4X结构启动子活性显著降低，而最小启动子没有受到影响(图4A） ●●●●。

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图4。

−994/−960区域内的GATA基序介导GATA2对格纳尔发起人。A、 GATA2诱导−994/−960的消音器活动格纳尔启动子区。将−994/−960区域的四个副本插入最小格纳尔pGL3载体中荧光素酶基因的启动子导向表达。最小值格纳尔启动子（称为最小启动子）包含与−136/−32相关联的−275/−226 SAP/SF1模块格纳尔包含转录起始位点的核心启动子。这个构造或最小值促性腺激素释放激素受体然后用pcDNA3空载体瞬时共转染启动子(黑色条)或使用GATA2表达载体(白色条)转化为CHO细胞。转染后40 h测量相对荧光素酶活性，如材料和方法结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）> 0.05. B、 包含GATA基序的10-bp序列的突变消除了GATA2的抑制作用。野生型pLuc1.1格纳尔或者将−971/−962和−959/−950突变的对应物与pcDNA3空载体瞬时共转染(黑色条)或GATA2表达载体(白色条)转化为αT3-1细胞。−971/−962序列的突变专门消除了GATA2的抑制作用，但也显著降低了启动子活性。结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）> 0.05.

为了进一步改进这些数据，通过在αT3-1细胞中进行瞬时转染实验，确定了携带10 bp突变的1.1-kb启动子对GATA2的反应性，该启动子改变了GATA基序（mut−971/−962）或下游区域（mut–959/−950）。与GATA2表达载体共转染后，mut−959/−950启动子的活性受到约30%的抑制，野生型启动子也受到同样的抑制(图4B） ●●●●。相反，GATA突变的启动子（mut−971/−962）在相同的环境中没有被显著抑制。然而，与野生型或mut−959/−950启动子相比，其基础活性显著降低，这与我们之前的观察结果一致(11). 这些数据表明，10-bp突变同时改变了GATA2的抑制作用和启动子对未知身份的反激活因子的反应能力。这些数据还表明，GATA2通过与反式激活因子竞争来调节其对启动子活性的抑制作用。

除了GATA基序之外，−994/−960元素的促性腺激素活性需要TAAT基序

对位于−994和−960之间的GATA元件上游的序列进行检查，发现存在三个TAAT基序，它们构成了受同源盒因子约束的共有元件的核心序列。使用位于最小启动子上游的突变双链寡核苷酸来研究这些基序的各自重要性。这些结构通过上述瞬时转染进行测试。在三个TAAT基序中，只有第二和第三个基序（mut2，mut3）似乎参与启动子激活(图5A） ●●●●。此外，尽管第二个TAAT基序（mut2）的突变仅部分降低了−994/−960区域的活性，但mut3完全消除了其活性。相反，影响第一TAAT基序（mut1）的突变显著增强了启动子活性，表明该区域是抑制因子的靶区。

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图5。

−994/−960区域是一个双功能元件，传递消音器和增强器特性。A、 −994/−960区域内活性基序的突变诱导启动子活性的激活或抑制。与−994/−960启动子序列对应并携带指示突变的双序列寡核苷酸(装箱的/颠倒的)在潜在的活性基序中设计、合成并融合到一个最小的启动子，将荧光素酶基因的表达导向pGL3载体。此处最小启动子由与−35/+35核心相关联的−275/−226 SAP/SF1模块组成Prl公司启动子。通过瞬时转染αT3-1细胞来评估单个和组合突变的效率，如图3图例。B、 −994/−960序列的多重化导致启动子活性成比例增加。在三个TAAT基序（mut1-2-3）上突变的−994/−960区域或其对应区域被多重聚合并插入最小基序上游5′处格纳尔启动程序（参见图4A） 到pGL3矢量中。然后通过瞬时转染αT3-1细胞对每个序列包含一到八个拷贝的构建物进行测试，如图3。结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）> 0.05. C、 EMSA数据分析概述了与功能活性基序相对应的三种特定复合物。对αT3-1核提取物（NE）进行EMSA，如材料和方法所有竞争性寡核苷酸（参见图5A代表序列）以500倍过量使用。SC显示为箭头从竞争实验中推断并指出了每个复合物中涉及的相应DNA模体。

为了检查这种效应是否是由偶然插入激活序列引起的，生成并测试了另外两个突变体（mut4、mut5）。这两个突变体证实在包括第一个TAAT基序在内的−994/−960区域的5′端存在抑制元件。在WGATAR基序中也进行了突变。出乎意料的是，2-bp突变（GATAmut）或其缺失（GATAdel）导致启动子活性降低，这表明除了通过GATA2结合传递沉默活性外(图4)，该基序还通过另一个尚未确定其身份的因子增强启动子活性。这些数据符合一个假设，即抑制因子和刺激因子竞争相同的反应元件或位置相近的反应元件。最后，野生型序列的多重聚合，多达8个拷贝，导致启动子活性急剧增加，这与拷贝数成正比(图5B） ●●●●。当转染到非促性腺激素CHO细胞中时，野生−994/−960多聚体无效，表明−994/−950区域的激活仅发生在促性腺细胞环境中（数据未显示）。相反，TAAT突变序列的多聚体在αT3-1细胞中不活跃，从而重申了TAAT基序在−994/−960区域的促性腺激素特异性激活中的关键作用(图5B） ●●●●。

EMSA分析表明TAAT和GATA基序参与了三种特殊复合物的形成

然后通过EMSA分析−994/−960元素，以评估其与αT3-1细胞核提取物培养时的结合能力。在没有未标记竞争物的情况下，观察到三个移位复合物（SC），称为SC1、SC2和SC3(图5C） ●●●●。这些配合物随着同系物未标记竞争物浓度的增加而逐渐被取代，从而证明了这些配合物的特异性。第四个定义松散的复合物被确定为非特异性，不再考虑。使用三个TAAT基序（mut1-2-3）上突变的寡核苷酸竞争只能阻止SC2的形成，这表明SC1和SC3复合物涉及这些TAAT基模。相反，与GATA基序（GATAdel）相对应的5 bp缺失寡核苷酸的过量竞争阻止了SC1和SC3的形成，表明SC2复合物涉及GATA基模(图5C） ●●●●。此外，使用各种突变序列的竞争分析可以识别与每个复合物形成相关的基序，TAAT 1参与SC3复合物的形成，TAAT 2和3参与SC1复合物的生成(图5C） ●●●●。这些数据得到了突变标记探针（GATAdel，mut2-3）结果的支持（数据未说明）。总之，SC1是与TAAT 2和3相互作用的结果，SC2是与GATA基序相互作用的产物，SC3是与TAAT1相互作用的。

−994/−960元素（D-LIRE）被LIM-HD蛋白ISL1和LHX3激活

然后考虑了参与−994/−960元件激活的促性腺激素因子的身份。与其他同源盒相关因子一样，LIM-HD蛋白与包含核心TAAT基序的共有元件结合。我们之前证明，远端增强子3′端（−873/−852）的LIRE基序对促性腺激素αT3-1细胞系中LHX3和ISL1的过度表达有反应(12). 然而，该基序的缺失仅部分消除了LIM-HD因子诱导的刺激，表明大鼠体内存在更多的LIM-HD反应元件格纳尔发起人。鉴于TAAT基序在促性腺激素细胞中的关键作用，因此我们假设−994/−960区域也可能是LIM-HD因子的靶点。与此假设一致，远端增强子（GnSE）从−1135延伸至−753，当位于最小值上游时，足以产生LIM-HD反应性Prl公司启动子，而−475/−32近端结构域无效（未图示）。在αT3-1细胞中，位于最小启动子上游的GnSE的不同片段能够对LIM-HD因子作出反应。特别是，含有−1063/−948片段（5′GnSE）的构建物诱导了对LIM-HD过度表达的反应，而与之相反的是，排除−994/−960区域的−1135/−1028和−1135/−987增强子片段没有观察到反应（补充图5）。

因此，在异源CHO细胞系中使用包含多聚−994/−960元素的先前构建物测试LHX3/ISL1组合。LIM-HD蛋白诱导的启动子活性刺激与多聚元素的数量成正比(图6A） ●●●●。相反，在三个TAAT基序上突变的多聚体对LIM-HD蛋白完全不敏感。此外，通过共转染含有kruppel-associated box domain（KRAB-LHX3）的LHX3蛋白的显性负性衍生物，性腺细胞中多重聚合的−994/−960序列引发的强烈活性显著降低(32)，表明内源性LHX3参与−994/−960区域的促性腺激素激活(图6B） ●●●●。总之，这些数据强烈表明，−994/−960元素是第二个LIRE，可以通过一个或多个TAAT基序由ISL1/LHX3组合激活，随后被称为D-LIRE，识别的第一个LIRE（−873/−852）被称为近端LIRE（P-LIRE）。然后使用编码ISL2、LHX5、LHX9以及ISL2和LHX3突变或变异形式的表达载体测试D-LIRE的LIM-HD特异性。D-LIRE元素显示出与P-LIRE相同的特异性，因为只有LHX3/ISL1或LHX3/ISL2组合有效（补充图6）。突变或变异形式的ISL2和LHX3（LHX3b）单独或与ISL1结合均无效。此外，其他LIM-HD平行记录（如LHX5和LHX9）无效，表明D-LIRE具有严格的特异性。

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图6。

与GATA2相比，LIM-HD蛋白LHX3和ISL1刺激−994/−960区域的启动子活性。A、 LHX3和ISL1刺激−994/−960区域的启动子活性。包含−994/−960区域多聚体或在三个TAAT基序（mut1-2-3）上突变的等效序列的荧光素酶结构体（参见图5A） 与LHX3和ISL1表达载体共转染(黑色条)或等量的pcDNA3空向量(白色条)转化为CHO细胞。转染后40 h测量相对荧光素酶活性，如材料和方法结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。B、 LHX3的显性-阴性形式抑制−994/−960区域的启动子活性。将含有多重聚合−994/−960序列的所示荧光素酶构建物与LHX3、KRAB-LHX3或等量的空pcDNA3载体（对照）在αT3-1细胞中共转染。结果为平均值±标准偏差至少进行三次独立实验，一式三份。C、 增加GATA2剂量逐渐降低LHX3/ISL1诱导的刺激。在CHO细胞中以固定浓度的LHX3和ISL1表达载体（每孔10 ng）和增加GATA2表达载体浓度（每孔2.5到20 ng）共同转染含有在三个TAAT基序（D-LIREmut 4X）上突变的四个D-LIRE（D-LIRE 4X）或D-LIRE拷贝的荧光素酶构建物。如图所示，通过添加pcDNA3使含有巨细胞病毒启动子的载体的总浓度（40ng/孔）保持恒定。结果为平均值±标准偏差一式三份的三个独立实验。***，P（P）< 0.001; **,P（P）< 0.01; 纳秒，P（P）> 0.05.

为了评估LIM-HD蛋白和GATA2之间的功能性相互作用，使用多聚D-LIRE 4X和D-LIREmut 4X（在三个TAAT基序上突变）荧光素酶构建物在CHO细胞中进行瞬时转染试验，该荧光素素酶构建体与固定剂量的LIM-HD表达载体共同转染，并增加GATA2表达载体的浓度(图6C） ●●●●。在存在最低浓度的GATA2表达载体（是LIM-HD载体的四分之一）的情况下，与突变的对应物相比，LHX3/ISL1对野生型D-LIRE结构的活性仍然具有高度显著的刺激作用。GATA2表达载体浓度的逐渐增加导致LHX3/ISL1诱导的野生型启动子活性刺激逐渐减少，直到野生型和突变D-LIRE结构之间的差异变得不显著。这发生在GATA2表达载体超过LHX3/ISL1异二聚体两倍的情况下。这些数据表明，GATA2对通过TAAT基序介导的LHX3/ISL1转录效应产生负向干扰。

GATA2、LHX3和ISL1相互作用体内与远端区域格纳尔发起人

鼠标的检查格纳尔启动子显示，除位于−363/−342的P-LIRE同源物外，D-LIRE的小鼠同源物也存在于远端区域（−961/−927）。该序列与大鼠序列具有高度同源性(图7A） ●●●●。正如预期的那样，老鼠序列引发了强烈的反应顺式-将最小启动子置于上游并在促性腺激素细胞环境中使用瞬时转染进行测试时的作用刺激(图7B） ●●●●。小鼠序列中第一个TAAT的缺失并没有减少其顺式-大鼠突变序列数据的预期作用效率(图5A） ●●●●。相反，小鼠序列甚至比大鼠同源序列更有效(图7B） 如之前观察到的突变改变了大鼠D-LIRE的5′区，即mut1、mut4和mut5。

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图7。

小鼠启动子通过相当于大鼠启动子−994/−960区域的元素招募GATA2和LIM-HD蛋白。A、 大鼠和小鼠LIM-HD和GATA反应元件的结构保守性格纳尔发起人。使用欧洲生物信息研究所提供的ClustalW2程序对大鼠和小鼠启动子序列进行比对(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). 两个启动子的编号从ATG翻译起始密码子开始，腺嘌呤被认为位于+1位。P-LIRE位于小鼠启动子的近端，反义链（−）位于−342/−363，而大鼠启动子的相应序列位于感义链（+）的远端，位于−852/-873。相反，被称为D-LIRE的−994/−960区域位于小鼠（−927/−961）和大鼠启动子的远端位置。B、 小鼠D-LIRE比同等的大鼠启动子序列具有更高的增强子活性。通过瞬时转染αT3-1细胞，比较大鼠和小鼠D-LIRE序列的增强子活性。大鼠D-LIRE的5′序列，特别是TAAT 1赋予消音器特性。这部分序列在小鼠D-LIRE中略有不同，在5′端有三个8 bp的错配。因此，这可以解释其更大的增强子性质。C、 P-LIRE附近TSS和D-LIRE处的ChIP。使用针对三甲基化组蛋白H3赖氨酸4（atriMeK4）、三甲基化组蛋白H3赖氨酸27（atriMeK27）、磷酸化形式的聚合酶2（aPol II）、LHX3、ISL1、ISL2、GATA2和GATA3的抗体，对从免疫沉淀的LβT2染色质纯化的DNA进行包含P-LIRE和D-LIRE的区域的PCR扩增。用溴化乙锭染色琼脂糖凝胶和实时PCR进行半定量PCR分析(黑色条)按照中所述进行材料和方法“No AB”对应于在没有抗体的情况下获得的信号，用作阴性对照。将从非免疫沉淀染色质（输入样品）中纯化的DNA稀释20倍，进行PCR并用作阳性对照。

然后我们对小鼠进行了ChIP分析格纳尔LβT2细胞中的启动子。D-LIRE位于小鼠启动子中距离P-LIRE约600 bp处，距离刚好足以区分ChIP分析中两个不同基序上发生的结合事件。相反，在大鼠启动子中，这两个基序在远端GnSE中仅相距60bp，因此在经典的ChIP分析中无法区分。为了评估D-LIRE附近的染色质构象，测试了两个染色质标记：组蛋白H3的赖氨酸4三甲基化（triMeK4-H3）和组蛋白H4的赖氨酰27三甲基化，分别作为基因活性和非活性的标记(33). 使用针对triMeK4-H3和triMeK27-H3的抗体免疫沉淀交联染色质，将这两个标记在D-LIRE序列中的比率与在转录起始位点（TSS）观察到的比率进行比较(图7C） ●●●●。然后使用专门设计的引物扩增每个大约200 bp长的启动子区域。毫无疑问，在D-LIRE附近观察到的triMeK4-H3-和triMeK27-H3-免疫沉淀DNA的比率与在TSS观察到的比率相等，其中triMeK4-H3-免疫沉淀的DNA大量过剩(图7C） ●●●●。相反，在上游8kb时，比率接近1（未说明）。这些数据表明D-LIRE位于活性染色质结构域中。还使用了针对活性形式RNA-Pol-II的抗体。正如预期的那样，TSS的启动子区域被抗聚合酶II抗体高效沉淀(图7C） ●●●●。D-LIRE区域也有免疫沉淀，但半定量PCR获得的信号强度弱于TSS区域。这些数据通过定量实时PCR进一步得到证实，显示抗Pol-II免疫沉淀后TSS在D-LIRE区域富集了5倍。这表明，在本研究中使用的ChIP条件下，特别是染色质剪切，D-LIRE区域可以与位于小鼠启动子下游600 bp处TSS附近的P-LIRE区域区分开来。

免疫沉淀与针对LHX3、ISL1、ISL2、GATA2和GATA3的抗体平行进行。抗LHX3抗体的免疫沉淀显示，LIM-HD因子不仅在TSS周围招募，而且在D-LIRE也招募。同样，在近端（TSS）和远端（D-LIRE）招募ISL1格纳尔与LHX3相比，LβT2细胞的启动子区效率较低。这些数据通过实时定量PCR得到了证实。更重要的是，GATA2（而非GATA3）显然在两个启动子域都被招募，这强烈表明GATA2与D-LIRE相互作用体内以及LHX3和ISL1。

LHX3、ISL1和GATA2绑定D-LIRE在体外

在本研究过程中，如上所述，使用LβT2细胞的核提取物与抗GATA2抗体预孵育4 h，并使用来自小鼠和大鼠启动子的标记D-LIRE探针进行EMSA。然而，没有观察到可以证实GATA2和D-LIRE直接相互作用的预期超位移（未图示）。为了证明GATA2和LIM-HD蛋白与D-LIRE的相互作用，然后使用生物素化D-LIRE或D-LIREmut1-2-3八聚体（称为MUT）与−275/−226融合，对αT3-1和LβT2细胞的核提取物进行DNA亲和层析，这是一种更灵敏的方法格纳尔启动子序列作为探针。同时，八聚体SAP序列（−260/−246）用作阴性对照。如图所示(图8A、，左上面板)，一种抗LHX3抗体与D-LIRE探针释放的αT3-1洗脱液中存在的单个蛋白质物种反应。相反，携带突变TAAT基序的D-LIRE探针没有保留任何与LHX3在免疫学上相关的蛋白质，这表明TAAT基模是D-LIRE和LHX3之间物理相互作用的特殊需要。使用抗ISL1抗体（未图示）进行了类似实验。在相同条件下，D-LIRE探针洗脱液的ISL1免疫染色导致极微弱的信号。突变D-LIRE序列的洗脱液未检测到阳性信号。突变和野生型D-LIRE探针中包含的−275/−226启动子序列包含SF1响应元件，并用作内部控制。正如预期的那样，使用抗SF1抗体进行的实验不仅通过野生型探针的洗脱液，也通过突变的D-LIRE探针，产生了强烈的信号，表明TAAT突变并没有改变探针的总结合能力(图8A、，左中面板). 最后，针对EGR1（一种不相关的转录因子）的抗体没有检测到信号(图8A、，左下面板)或阴性对照序列，无论抗体测试结果如何。然后用LβT2核提取物进行同样的方法，并证实LHX3和ISL1在D-LIRE上的TAAT依赖性结合(图8A、，右侧面板). 重要的是，GATA2也清楚地被D-LIRE探针捕获，但没有被控制探针捕获。有趣的是，TAAT基序的突变（MUT探针）强烈降低了GATA2与D-LIRE的结合，表明TAAT基模，至少其中一部分，除了LIM-HD蛋白外，还与GATA2相互作用。EMSA研究证实了这一点，在这些研究中，我们一致观察到异源一致GATA序列取代SC2的显著能力(图8B） ●●●●。同样重要的是，异源共有ISL1序列也能够取代相同的SC2复合物，尽管与共有GATA序列相比浓度更高(图8B） ●●●●。这表明ISL1在D-LIRE的3′端与TGATAA基序相互作用或在其附近相互作用，可能会消除GATA2诱导的抑制作用。相反，GATA2可能阻止LIM-HD诱导的格纳尔启动子活性，尤其是在过度表达实验中。

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图8。

GATA2和LIM-HD蛋白与−994/−960区域（D-LIRE）相互作用，并在成人垂体内共定位。A、 DNA亲和层析显示GATA2和LIM-HD蛋白与−994/−960区域（D-LIRE）结合。通过将αT3-1或LβT2核提取物与链霉亲和素磁珠相连的生物素化DNA序列孵育来评估结合特异性。D-LIRE探针包含与包含SF1元素的−260/−237区域的一个副本相关联的−994/−960区域的八个副本。MUT探针是相同的，只是每个−994/−960区域拷贝上的三个TAAT基序都发生了突变。钴探针含有8个不含SF1元件的−260/−246启动子区拷贝，用作阴性对照。将与探针特异结合的蛋白质洗脱（洗脱液）并与未结合的蛋白质（上清液）一起在12%SDS-PAGE上进行解析，并使用所示的抗LHX3、抗SF1、抗EGR1、抗ISL1和抗GATA2抗体通过Western blot进行分析。B、 GATA共识调查是SC2的高效竞争对手。EMSA分析按照图5C.竞争实验中使用了特定的ISL1和GATA共识探针。在ISL1共识探针超过500倍的情况下，观察到SC2轻微位移，而在GATA共识探针超过50倍的情况下同一复合物的有效位移。C、 ISL1和GATA2的Colocalization with格纳尔成人垂体中的启动子活性。2个月大转基因雄性小鼠的大脑[Tg(Gnrhr-ALPP公司)1Jnl]进行解剖和处理，如材料和方法.ALPP活动反映格纳尔启动子活性如材料和方法使用ISL1和GATA2抗体进行免疫组化。DAPI被用作反染色。ALPP活性和ISL1和GATA2免疫反应在这里显示为假白色,红色、和绿色颜色。表达ALPP和ISL1的细胞示例(白色箭头)、ALPP、GATA2和ISL1(白色箭头)，或仅ALPP(空箭头)如图所示。比例尺，100微米。

我们非常感谢Gilles Salbert博士（法国雷恩第一大学）、Simon J.Rhodes教授（印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院）、Shigekazu Sasaki博士（日本滨松滨松大学医学院）和Robert S.Viger博士（加拿大魁北克市拉瓦尔大学）感谢他们在为我们提供表达载体方面的合作。我们还感谢P.Mellon博士（加利福尼亚大学拉荷亚分校）为我们提供了小鼠促性腺激素细胞系。

这项工作得到了国家科学研究中心、巴黎第七大学和国家科学研究局（GrantANR-08-CES-011-03). A.-L.S.由国家教育部（Ministere de L'Education Nationale，de la Recherche et de la Technologie）的奖学金资助。

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