Identification of targets of c-Src tyrosine kinase by chemical complementation and phosphoproteomics

doi:10.1074/mcp.M111.015750

.2012年8月；11(8):355-69.

doi:10.1074/mcp。M111.015750。 Epub 2012年4月12日。

用化学互补和磷酸蛋白质组学鉴定c-Src酪氨酸激酶的靶点

伊莎贝尔·马丁内斯·费兰多¹, Raghothama Chaerkady公司, 钟军（音）, 亨利克·莫利纳, 哈里斯·K·C·雅各布, 凯蒂·赫伯斯特·罗宾逊, 贝弗利·M·丹西, 维克拉姆·卡丘, 罗恩·博斯, 金章（Jin Zhang）, 阿克希利什·潘迪, 菲利普·科尔

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用化学互补和磷酸蛋白质组学鉴定c-Src酪氨酸激酶的靶点

伊莎贝尔·马丁内斯·费兰多等人。分子细胞蛋白质组学. 2012年8月.

.2012年8月；11（8）：355-69。

doi:10.1074/mcp。M111.015750。 Epub 2012年4月12日。

作者

伊莎贝尔·马丁内斯·费兰多¹, 拉霍塔玛·查尔卡迪, 钟军（音）, 亨利克·莫利纳, 哈里斯·K·C·雅各布, 凯蒂·赫伯斯特·罗宾逊, 贝弗利·M·丹西, 维克拉姆·卡丘, 罗恩·博斯, 金章（Jin Zhang）, 阿克希利什·潘迪, 菲利普·科尔

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯医学院药理学和分子科学系，邮编：21205。

采购管理信息： 22499769
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内政部： 10.1074/mcp。M111.015750号

摘要

细胞原癌基因c-Src是一种参与细胞生长和细胞骨架调节的非受体酪氨酸激酶。尽管在多种人类癌症中存在失调，但其确切功能尚未完全了解。鉴定c-Src底物仍然是一项重大挑战，因为没有简单的方法直接刺激其活性。在这里，我们将突变c-Src的化学拯救与全局定量磷酸蛋白质组学相结合，以获得第一个高分辨率的酪氨酸磷酸化事件范围快照，这些事件在特定c-Src-刺激后立即在细胞中发生。通过抗磷酸酪氨酸抗体富集后，我们鉴定出29种潜在的新型c-Src底物蛋白。酪氨酸磷酸肽图谱允许在213个磷酸蛋白上鉴定382个非冗余酪氨酸磷酸肽类。基于细胞培养定量的氨基酸稳定同位素标记允许检测97种非冗余酪氨酸磷酸肽，其磷酸化水平通过c-Src增加。这里展示了大量以前未经特征化的c-Src推测蛋白靶点和磷酸化位点，其中大多数在信号传递和细胞骨架网络中发挥关键作用，特别是在细胞粘附中。整合素信号通路和黏着斑激酶信号通路是化学救援激活c-Src的两条最具改变的通路。在这种情况下，我们的研究揭示了c-Src激活和GTPase Rap1之间的时间联系，已知其可刺激整合素依赖性粘附。c-Src的化学救援提供了一种工具，可以剖析Rap1鸟嘌呤交换因子（C3G）激活的时空机制，C3G是一种已确定的在局灶粘附信号中起作用的潜在c-Src-底物。除了揭示c-Src在细胞中的作用，特别是在Crk-C3G-Rap1途径中的作用外，这些结果还举例说明了一种以高特异性和动力学分辨率全面了解非受体酪氨酸激酶功能的策略。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**咪唑对c-Src的化学救援。** A类，提出了咪唑的R390A c-Src化学救援机制，表明咪唑与底物的催化碱Asp-388和Tyr的相互作用（基于蛋白质数据库条目3GEQ）。B类，比较咪唑处理细胞与未处理细胞的磷酸酪氨酸谱。通过咪唑处理（10 m）诱导酪氨酸磷酸化米稳定转染c-Src R390A和D388N SYF（阴性对照）的SYF细胞。对细胞进行裂解，并用4G10抗磷酸酪氨酸抗体对整个裂解产物进行蛋白质印迹。

**图2。**
**基于SILAC的定量磷酸蛋白质组方法的实验设计方案。**稳定转染R390A c-Src的SYF MEF细胞被分成两个群体，分别在轻培养基或重培养基中生长。在重培养基中培养的细胞群用10 m米咪唑作用5min，在轻培养基中培养的未经处理。细胞裂解物按相等比例混合。A类，蛋白混合物与抗磷酸化酪氨酸抗体孵育以富集酪氨酸磷酸化蛋白。富集部分进行凝胶内胰蛋白酶化。B类蛋白质混合物首先用胰蛋白酶消化，然后与抗磷酸酪氨酸抗体孵育以富集酪氨酸磷酸化肽。在这两种情况下，通过LC-MS/MS分析富集样品。

**图3。**
**已识别和量化的磷酸蛋白的分布。** A类，总结了R390A c-Src SYF MEF细胞中所有蛋白质经c-Src-化学救援后磷酸化的折叠变化。指出了已知的Src蛋白底物。重/轻（H/L）比>1.2的蛋白质(红色)增加其酪氨酸磷酸化水平，H/L比<0.8的人(绿色)降低酪氨酸磷酸化水平。酪氨酸磷酸化水平（0.8<H/L比<1.2）无明显变化的蛋白质显示在灰色. The饼图表示酪氨酸磷酸化水平上调（H/L>1.2）、恒定（0.8<H/L<1.2）或下调（H/L<0.8）的蛋白质分布。B类c-Src解救后酪氨酸磷酸化水平升高的已鉴定蛋白质的功能分布。

**图4。**
**用免疫沉淀法验证R390A和D388N c-Src SYF细胞经10mm处理后的蛋白磷酸化米持续5分钟。**使用与感兴趣蛋白对应的市售抗体进行免疫沉淀，并使用4G10 Tyr（P）抗体以及蛋白特异性抗体进行免疫印迹。波形蛋白、C3G、张力蛋白、苦参素、核磷蛋白和GSK-3β是一些新的潜在直接c-Src底物，通过免疫沉淀-免疫分析验证。

**图5。**
**R390A c-Src SYF MEF细胞中c-Src-解救后酪氨酸磷酸化上调的已鉴定磷酸肽概述。**所有检测到的上调磷酸肽均显示其是否新颖(红色)或已知(红色和黑点)c-Src基底位置。如图所示，相应的蛋白质跨越多种细胞功能，如极性、肌动蛋白重塑、适配器、激酶、磷酸酶和鸟嘌呤交换因子/GTPase激活蛋白，并在c-Src激活后被酪氨酸磷酸化调节。

**图6。**
**c-Src上调磷酸化蛋白质组的摄入途径分析。** A类，典型途径富集图(x个axis）建立在52个c-Src上调磷酸蛋白的列表上。这个*右y轴*(线)表示富集百分比（c-Src上调蛋白数量与途径中包含的总蛋白数量之间的比率）。这个*左y轴*(钢筋)表示富集的显著性，使用Benjiamini-Hochberg多重测试校正（as−log）进行计算₁₀属于第页值。从Ingenuity Systems从c-Src上调磷酸蛋白列表中获得的完整路径列表中，值为−log（BH）的路径-*P（P）*)表示≥6。B类，基于52个c-Src上调磷酸蛋白列表构建的本体富集图（x轴）。这个年轴表示富集的显著性，使用Benjiamini-Hochberg多重测试校正作为对数计算₁₀属于第页值。

**图7。**
**c-Src在局灶粘附信号中的作用。**图中显示了整合素参与局部粘附激活的信号通路以及由此产生的下游信号事件。还总结了局部粘连的生物学功能。对于涉及的每一种蛋白质，都指出了c-Src已知底物的位点。在我们的实验中发现的磷酸酪氨酸位点的调节明显增加(黑色)，未调制(灰色)，或减少(白色). 在确定的位置中，一些是已知的c-Src基底(圆形内有X）。

**图8。**
**确定的c-Src基底C3G活化机制的时空解剖。** A类，使用抗-Tyr（P）-514-C3G抗体的蛋白质印迹显示，在R390A c-Src SYF细胞中，但在D388N c-Src SYF细胞中，在c-Src拯救后1分钟后，C3G ISOFORM中酪氨酸514的磷酸化水平增加。使用抗C3G抗体的Western blot显示，在R390A c-Src SYF和D388N c-Src-SYF细胞中，沿不同时间点的负荷相等。*伊米德*，咪唑。B类使用C3G免疫沉淀和Crk印迹的联合免疫沉淀显示，咪唑处理1分钟后，C3G-Crk结合增加，在R390A c-Src SYF细胞中持续到2.5分钟，在5分钟时减少，但在D388N c-Src-SYF细胞中没有。C类在Crk中使用抗Tyr（P）-221的Western blot显示，c-Src解救后磷酸化逐渐增加，在R390A c-Src-SYF细胞第5分钟达到最高水平，但在D388N c-Src-SYF细胞中没有达到最高水平。在C3G和Crk结合降低的同时，磷酸化达到最大水平。D类，R390A c-Src/SYF细胞用10 m米咪唑和固定在不同的时间点。用C3G（罗丹明）和Tyr（P）-514-C3G（FITC）染色检测C3G和Tyr-514-C3G的定位，用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚染色检测细胞核。通过共焦显微镜获得图像。显示了放大100倍的典型图像。细胞（n＞40）根据表型（胞质与外围）和量化。定量分析C3G和Tyr（P）-514-C3G细胞定位，并将其作为咪唑处理时间的函数进行测量。这些图像是在放大40倍的共焦显微镜下拍摄的，如图所示补充图6对每种情况下的六个代表性图像（至少40个细胞）进行量化。对每一个细胞是否有外周染色进行评分。计算每幅图像的周边染色细胞比例，并结合每种情况的六幅图像计算平均值。将每个时间点标准化为时间0，并显示标准误差。统计显著性(第页<0.05）与时间相比，使用学生的t吨测试，并用*星号。E类*，R390A c-Src SYF细胞中c-Src-解救后Rap1激活(红色)和D388N c-Src SYF细胞(蓝色). 基于FRET的GTPase传感器Raichu-Rap1在用咪唑治疗8分钟以挽救c-Src活性后，沿细胞膜的FRET反应（Rap1激活指示剂）增加了10%。

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