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.2012;7（1）：e29771。
doi:10.1371/journal.pone.0029771。 Epub 2012年1月3日。

神经干细胞体外分化过程中LINGO-1的中和作用导致未成熟神经元的增殖

卡米拉·洛夫 1, 玛丽亚·弗恩奎斯特, 阿德里安·沃尔姆斯利, 尼古拉斯·马克隆德, 安娜·埃兰德森
附属公司

神经干细胞体外分化过程中LINGO-1的中和作用导致未成熟神经元的增殖

卡米拉·洛夫等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

识别可用于控制神经干细胞分裂及其向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的外部因素具有高度的科学和临床意义。在这里，我们表明Nogo-66受体相互作用蛋白LINGO-1是神经干细胞成熟对神经元的有力调节器。LINGO-1由E14小鼠胚胎的皮层神经干细胞表达，在神经干细胞分化的第一天抑制LINGO-1会导致神经元成熟度降低。与对照培养物中的神经元相比，对照培养物在分化6天后有较长的突起延伸，用抗LINGO-1抗体处理的培养物中神经元保持未成熟的圆形表型，突起很短。此外，与未经处理的对照培养物相比，LINGO-1的中和作用导致βIII微管蛋白阳性细胞增加三倍。通过使用BrdU掺入分析，我们发现LINGO-1中和培养物中的未成熟神经元正在分裂成神经细胞。与βIII微管蛋白和BrdU无双重阳性细胞的对照培养物相比，经抗LINGO-1抗体处理的培养物中36%的神经元在分化三天后增殖。TUNEL分析显示，与未经处理的对照培养物相比，经LINGO-1抗体处理的培养物在分化早期经历凋亡的细胞数量显著减少。综上所述，我们的研究结果表明LINGO-1在神经干细胞向神经元分化中具有新的作用，并建议使用LINGO-1抑制剂来补偿受损大脑中神经元细胞的丢失。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：人抗LINGO-1单克隆抗体由瑞士巴塞尔的诺华公司提供，独立于资金。然而，作者的结果是无偏见的。LINGO-1抗体已获得专利（WIPO专利申请WO/2008/058736）。作家阿德里安·沃尔姆斯利也受雇于诺华生物医学研究院。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。

数字

图1
图1。LINGO-1在神经干细胞分化过程中表达增加。
A） Western blot分析研究LINGO-1在NSPC分化过程中的表达。用抗LINGO-1抗体（诺华）免疫沉淀增殖细胞（第0天）和分化1-9天的NSPC的细胞裂解物，并用LINGO-1 ab（Abcam）印迹。LINGO-1存在于增殖和分化的NSPC中，但在分化过程中表达增加。B） 蛋白质定量显示，与增殖的NSPC（第0天）相比，分化9天的培养物中LINGO-1的表达增加了9倍。用针对LINGO-1（C–N）和nestin（C–E）、βIII微管蛋白（F–H）、GFAP（I–K）或CNPase（L–N）的特异性抗体进行双重免疫染色显示，NSPC、神经元和少突胶质细胞表达LINGO-1，但不表达星形胶质细胞。NSPC培养物在第0天（C-E）固定，分化培养物在有丝分裂原退出后第6天（F-N）固定。比例尺 = 20微米。
图2
图2。在NSCP分化过程中LINGO-1的中和作用导致神经元未成熟。
为了研究LINGO-1中和作用对NSPC分化的影响，在有丝分裂原退出后，在LINGO-1 ab（诺华）不存在（A、C和E）或存在（B、D和F）的情况下培养NSPC 6天。将细胞固定并用抗βIII微管蛋白（A–B）、GFAP（C–D）或CNPase（E–F）的特异性抗体染色。在对照培养物（A）中，神经元相当成熟，具有多个长的延伸过程，但在用LINGO-1抗体处理的培养物（B）中，神经细胞具有更不成熟的表型，只有一个或两个短过程。对照培养物和LINGO-1抑制培养物的星形胶质细胞染色（C-D）或寡聚胶质细胞染色法（E-F）无明显差异。比例尺 = 20微米。
图3
图3。LINGO-1的中和作用导致神经元的百分比增加。
A） 对神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的数量进行计数，并将其绘制为特异性标记阳性细胞与总细胞数的比率（DAPI）。分化6天后，与未经处理的对照组相比，LINGO-1 ab处理的培养物中神经元的百分比增加了3倍。GFAP阳性细胞的百分比只有轻微但显著的增加，CNPase阳性细胞的比例没有发现差异。B） 比较成熟和未成熟神经元在βIII微管蛋白阳性细胞总数中的百分比，发现在分化6天后，LINGO-1 ab处理的培养物中未成熟细胞比未处理的对照培养物增加了7倍。***表示p<0001，**表示p<0.01，*表示p<0.05。
图4
图4。LINGO-1中和促进细胞增殖。
BrdU标记用于研究LINGO-1中和对细胞增殖的影响（A–D）。细胞在固定前暴露于BrdU 16小时，并用针对BrdU（红色）和DAPI（蓝色）的特异性抗体染色。E） 计算合并BrdU的细胞数，并绘制成BrdU阳性细胞与总细胞数的比值。F） 在分化的第0天、第1天、第3天和第6天测量抗LINGO-1抗体处理的和未处理的对照培养物中的总细胞数。使用细胞刮板收集每个培养皿中的细胞，并使用NucleoCounter™进行计数。绘制了每皿细胞总数的平均值。***表示p<0001，**表示p<0.01，*表示p<0.05和比例尺 = 20微米。
图5
图5。LINGO-1的中和作用导致增殖神经母细胞的百分比增加。
为了研究LINGO-1中和培养物中未成熟神经元是否增殖，我们用针对BrdU（红色）、βIII微管蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）的特异性抗体对细胞进行双重标记。NSPC在第0天（A–B）固定或仅在含有抗LINGO-1抗体（G–J）的培养基中分化3天（C–D）或6天（E–F）。固定前16小时将BrdU加入培养物中。比例尺 = 20微米。
图6
图6。用抗LINGO-1抗体处理的培养物中TUNEL阳性细胞数量减少。
对NSPC和在不存在或存在LINGO-1 ab（A–D）的情况下分化1天和3天的细胞的平行培养物进行TUNEL分析。分化第3天对照培养物（A–B）和LINGO-1中和培养物（C–D）的代表性照片，TUNEL（绿色）和DAPI（蓝色）。E） 将经历凋亡的细胞计数并绘制为细胞总数的比率。***表示p<0001，**表示p<0.01，*表示p<0.05和比例尺 = 20微米。
图7
图7。LINGO-1中和对PKB/c-Akt磷酸化没有影响。
A） Western印迹分析用于研究在不存在或存在LINGO-1 ab的情况下，PKB/c-Akt磷酸化在分化NSPCs中的作用。总细胞裂解物用于抗PKB/c-Akt抗体（Akt）和抗磷酸化PKB/c-Akt抗体（p-Akt）的免疫印迹。B） 测量并绘制磷酸化Akt的比率。
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参考文献

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