Dimerization of ABCG2 analysed by bimolecular fluorescence complementation

doi:10.1371/journal.pone.0025818

.2011;6（10）：e25818。

doi:10.1371/journal.pone.0025818。 Epub 2011年10月3日。

双分子荧光互补法分析ABCG2的二聚体

阿梅娜·海德¹, 黛博拉·布里格斯, 蒂姆·J·赛尔夫, Hannah L Chilvers公司, 尼古拉斯·D·霍利迪, 伊恩·德·克尔

附属公司

PMID： 21991363
PMCID公司：项目经理3185054
内政部： 10.1371/journal.pone.0025818

双分子荧光互补法分析ABCG2的二聚体

阿梅娜·海德等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（10）：e25818。

doi:10.1371/journal.pone.0025818。 Epub 2011年10月3日。

作者

阿梅娜·海德¹, 黛博拉·布里格斯, 蒂姆·J·赛尔夫, Hannah L Chilvers公司, 尼古拉斯·D·霍利迪, 伊恩·德·克尔

附属

¹英国诺丁汉大学生物医学学院。

PMID： 21991363
PMCID公司：项目经理3185054
内政部： 10.1371/journal.pone.0025818

摘要

ABCG2是三种人类ATP结合盒转运体之一，在功能上能够从细胞中输出多种底物。ABCG2多药转运活性在白血病和一些实体肿瘤中的生理后果是获得癌症多药耐药性。ABCG2的一级结构推断出最小功能运输单元是同二聚体。在这里，我们研究了双分子荧光互补方法检测ABCG2二聚体的能力，并探讨了单个氨基酸取代在二聚体形成中的作用。ABCG2用静脉荧光蛋白（vYFP）片段进行标记，这种标记不会干扰贩运或功能。两种携带YFP N端和C端片段的蛋白质的共表达导致它们的结合，并通过荧光显微镜和流式细胞术检测二聚化。检测ABCG2中可能影响二聚体形成的点突变，以了解荧光互补信号的大小变化。双分子荧光互补（BiFC）显示了ABCG2二聚体的特异性形成，但BiFC分析未检测到由单一氨基酸取代引起的二聚体形成的变化。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。采用了BiFC原理和ABCG2 BiFC构造。**
A类BiFC的基本原理是发色团（此处为vYFP）的重新折叠和成熟，发色团发生在两个携带YFP蛋白质互补片段（红色和蓝色连锁形状）的蛋白质（此处显示为圆柱体）的相互作用中。B在目前的手稿中，由N端核苷酸结合域（橙色）和C端TMD（橄榄绿）组成的ABCG2被标记为全长YFP变体（黄色圆圈）或YFP变异体的互补片段，如红色和蓝色半球所示。YFP和片段的标记位于ABCG2 cDNA的5′（N末端）或3′（C末端）。

**图2。带有½YFP分子的N末端标记不会影响ABCG2蛋白在质膜上的表达和靶向性。**
A类如前所述转染HEK293T细胞，48小时后固定并与针对ABCG2细胞外表位的单克隆5D3抗体和与AlexaFluor 488偶联的二级抗体孵育，然后用DAPI反染并安装荧光显微镜。上面的面板显示了血浆中ABCG2的存在，下面的面板是5D3和DAPI的合并图像。B在与藻红蛋白（PE）结合的对照抗体（IgG-PE；绿色填充分布）或识别ABCG2-In细胞外表位的PE结合5D3（未填充分布）孵育后，通过流式细胞术对细胞进行转染和分析A类和B左边的列表示用vYN标记N末端的ABCG2（vYFP的残基2-173），右边的面板表示用vY标记N末端（vYFP的残基团156-239）的ABCG1。比例尺为10µm，数据代表至少4个独立转染。转染C细胞，通过SDS-PAGE和western blotting分析20µg全细胞裂解物，使用BXP-21鉴定ABCG2融合蛋白。这三个结构的表达水平是可比较的。在与vYFP的C末端融合时，观察到许多低分子量分解产物，尽管其程度是可变的。使用平行考马斯染色凝胶来验证相等的蛋白质负载量（数据未显示）。

**图3。带有½YFP分子的N末端标记不会影响ABCG2蛋白的功能。**
用YFP_ABCG2构建物（C-E）或阴性对照（空pcDNA载体；A）和阳性对照（His）瞬时转染HEK293T细胞₁₂-ABCG2），如方法和材料所述。转染后，将等分细胞与ABCG2底物米托蒽醌在有或无抑制剂烟曲霉素C（FTC）的情况下孵育，并通过流式细胞术测定细胞荧光。蓝色填充直方图表示在没有FTC的情况下细胞的荧光，并且在抑制剂（黑线）存在的情况下向右移位显示出与特征对照组相似的功能能力水平₁₂-ABCG2（B）。eYFP-ABCG2面板（C）中明显存在大量无荧光细胞，这是由于该结构的YFP荧光干扰造成的荧光伪影。这些图表代表了5个以上的独立实验。

**图4。YFP-ABCG2结构的互补发生在质膜上。**
单独表达半标记vYFP-ABCG2的结构(**A、 B类**)或者一起(C类)被转染到HEK293T细胞中，如左图所示。经5D3抗体免疫染色证实，构建物到达质膜（左侧面板）。用流式细胞仪对转染vYN-ABCG2或vYC-ABCG2构建物的细胞在515nm处未检测到荧光，但在共转染细胞中检测到YFP荧光（中间面板）。BiFC相互作用的确认通过荧光显微镜对固定细胞成像获得（右侧面板）。DAPI被用作核抗衡染色剂。在这些实验中，单个转染只产生DAPI标记的细胞核。数据代表至少4个独立实验。

**图5。ABCG2双分子荧光互补具有特异性。**
用表达eYFP-ABCG2（作为阳性荧光对照，A类)，补充标记为ABCG2的vYFP的一半(B)或与vYN-ABCG2和非特异性相互作用伙伴β2肾上腺素能受体（β2AR）和C末端vYC片段结合(C类). 活细胞成像（左侧面板）显示，所有三种转染均产生细胞荧光，表明同源（ABCG2:ABCG2）和非同源（ABCC2:β2AR）蛋白对互补。然而，用DAPI（中间板）固定和反染的细胞显示，来自ABCG2:ABCG2相互作用的BiFC信号是膜定位的，而来自ABCG2：β2AR相互作用的BiFC信号显示细胞质滞留。带有抗ABCG2抗体的细胞的免疫荧光进一步证明ABCG2:β2AR相互作用导致ABCG2在细胞内滞留。数据代表至少4个独立实验。

**图6。通过高含量筛选进行ABCG2 BiFC定量。**
如方法所述，将HEK293T细胞转染到96个平板中，使用表达vYN-ABCG2和vYC-ABCG2的成对构建物（面板**B、 C、D**)或仅表达vYC-ABCG2的单个结构(A类). 表达的ABCG2亚型为野生型(**A、 B类**)、E211Q(C类)和C603A(D类). 对于每次转染，显示了多孔共焦采集的两个代表性图像，为了清晰起见，有和没有Hoechst 33342染色细胞核。在分子器件IX微型平板阅读器上用40X物镜拍摄图像。E类BiFC阳性细胞的百分比按照方法中的描述进行测定，采用阴性（单次转染）设置背景以上荧光测定的阈值。F类检测每个ABCG2亚型的YFP互补的平均强度荧光水平，并在每个实验中将数据归一化为野生型ABCG2 BiFC的平均荧光强度。中的数据E类和F类是4-7个独立实验的平均值（±标准误差）。

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[2] Kerr ID，Jones PM，George AM。多药外排泵：原核ATP-结合盒转运体外排泵的结构以及对我们理解真核P-糖蛋白和同源物的意义。FEBS J.2010；277:550–563.-公共医学

[3] Higgins CF，《ABC转运体：从微生物到人类》，《细胞生物学年鉴》。1992;8:67–113.-公共医学

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