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.2011年4月1日；25(7):717-29.
doi:10.1101/gad.2016111。 Epub 2011年3月15日。

胰腺癌需要自噬来促进肿瘤生长

杨胜宏 1, 王晓旭, 吉安马科·孔蒂诺, 马克·利萨, 埃尔贡·萨欣, 郝强英, 亚历山大·鲍斯, 李英华, 杰恩·M·斯托梅尔, 贾科莫·德尔安托尼奥, 约瑟夫·莫特纳, 乔瓦尼·托农, 海吉斯, Orian S Shirihai公司, 克劳迪奥·多格里奥尼, 纳比尔·巴迪西, 亚历克·金默尔曼
附属公司

胰腺癌需要自噬来促进肿瘤生长

杨胜宏等。 基因开发. .

摘要

巨自噬（autophagy）是一种降解细胞器和大分子的调节分解代谢途径。自噬在癌症中的作用是复杂的，可能因肿瘤类型或背景而异。在这里，我们发现胰腺癌对自噬有明显的依赖性。胰腺癌原发肿瘤和细胞株在基础条件下自噬增加。遗传或药物对自噬的抑制会导致活性氧种类增加、DNA损伤增加和代谢缺陷，从而导致线粒体氧化磷酸化降低。总之，这些最终导致胰腺癌细胞在体外的显著生长抑制。最重要的是，通过基因手段或氯喹治疗抑制自噬可导致胰腺癌异种移植瘤和基因小鼠模型中的恶性肿瘤退化和生存期延长。这些结果表明，与其他癌症不同的是，自噬抑制可能通过阻止自噬上调作为一种反应性生存机制而与化疗或靶向药物协同作用，而自噬实际上是胰腺癌新生肿瘤生长所必需的，灭活这一过程的药物在治疗胰腺癌和其他类似依赖自噬的恶性肿瘤方面可能具有独特的临床用途。由于氯喹及其衍生物是有效的自噬抑制剂，几十年来已安全用于人类患者的多种目的，因此这些结果可立即应用于胰腺癌患者的治疗，并提供了一个非常需要的新的有利攻击点。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
PDAC具有高水平的基础自噬。(A类)PDAC细胞和对照组（HPDE（永生化正常HPDEs）、MCF7（乳腺癌）和H460（肺癌））感染表达GFP-LC3的逆转录病毒，在有血清的完整培养基中生长，然后固定并通过荧光显微镜分析LC3点的存在，LC3点代表自噬小泡。PDAC细胞中存在大量离散的自噬点，而每个对照细胞系仅显示GFP的弥漫表达。自噬细胞百分比（定义为存在五个以上病灶）如相邻直方图所示。所有八种PDAC细胞与HPDE细胞之间的差异具有统计学意义(P（P）经Fisher精确检验<0.05）。棒材，20μM。(B类)PDAC细胞和对照细胞在正常生长条件下培养，在没有和存在自噬抑制剂CQ的情况下测定每个细胞的LC3点数量A类注意，PDAC细胞的病灶相对于HPDE、H460和MCF7（暗纹条）显著增加。（^）与HPDE细胞相比的统计显著性。PDAC中的自噬通量升高，用CQ治疗时每个细胞点状突起增加就证明了这一点（浅灰色条显示CQ治疗后病灶增加）。星号表示与未经处理的细胞相比，CQ处理后的细胞在统计学上显著增加。(C类)8988T PDAC细胞中的自噬通量显示，在不同时间点用E64d+胃蛋白酶抑制素a和CQ抑制溶酶体蛋白酶后，LC3-II表达显著增加。(D类)使用进入长期蛋白质降解途径的GFP-Neo融合蛋白在8988T细胞中评估长期蛋白质降解。用FACS监测GFP的表达。这个左边面板显示，与第0天相比，第1天和第2天的GFP表达降低，表明在基础条件下自噬激活。这个正确的小组证明，CQ是一种自噬抑制剂，可以阻止这些细胞中的长期蛋白质降解。(电子)在MCF7细胞中评估长期蛋白质降解，如D类注意GFP表达的微小变化，表明基础自噬水平较低。这不受添加CQ的影响。
图2。
图2。
(A类)IHC在原发性PDAC的不同阶段评估裂解LC3的激活自噬。LC3在正常外分泌胰腺和低级别PanIN-1和PanIN-2病变中较低或缺失，而在所有高级别PanIN-3病变中染色上调并呈现泡状染色模式(A类)和PDAC(B类). （N） 肿瘤浸润的神经束，显示LC3的强劲表达。(C类)高倍放大肿瘤细胞，显示囊泡染色（箭头），提示存在自噬体。（Nu）细胞核。(D类)一个具有代表性的胰岛，显示出高水平的囊泡染色，与已知的β细胞自噬组成相一致。(电子)胰腺肿瘤的透射电镜显示自噬体与溶酶体融合（面板我; [arrow]自噬体；[箭头]溶酶体）和与溶酶体融合的自噬体（自溶体）（面板ii（ii）,三; 箭头）。
图3。
图3。
抑制PDAC细胞系中的自噬可减弱体外生长和致瘤性。(A类)四种不同PDAC细胞系（8988T、BXPC3、8902和Panc1）和对照细胞系H460和MCF7经CQ（6.25μM和12.5μM）抑制自噬或PBS作为对照处理后的生长曲线。PDAC细胞表现出剂量依赖性的生长抑制，而H460和MCF7细胞基础自噬率低，仅受到轻微影响。(B类)PDAC线和H460和MCF7细胞组中微摩尔CQ的IC50。请注意，与MCF7和H460相比，PDAC线路的IC50值较低。(C类)采用软琼脂试验评估CQ（10μM）抑制凤尾鱼非依赖性生长的能力。8988T和Panc1细胞的集落形成受到抑制，而MCF7和H460细胞则没有。直方图在下面显示了这些分析相对于未处理细胞的定量。误差线代表三倍。(D类)Bafilmycin A1是溶酶体酸化和自噬的抑制剂，可抑制PDAC锚定物非依赖性生长。细胞接种在软琼脂中，并用5 nM巴非霉素A1（木炭棒）或载体（浅灰色棒）处理。数据是相对于对照表示的，误差条代表三倍的标准偏差。请注意，Panc1和8988T PDAC细胞显著减少，但H460和MCF7细胞没有显著减少。
图4。
图4。
(A类)用两种不同的siRNA转染细胞以对抗必需的自噬基因ATG5（siA和B），或用对照的打乱的siRNA。所示为比较ATG5表达与对照siRNA的典型Western blot底部面板是一个actin加载控件。(B类)使用GFP-LC3分析评估ATG5 siRNA转染的8988T细胞的基础自噬。直方图在下面显示了自噬细胞的百分比（超过五个点），并显示出与对照组相比，siATG5表达细胞（星号）在统计学上显著减少(P（P）<0.05费希尔精确试验）。(C类)用对照或siRNA转染细胞至ATG5，并进行软琼脂测定。两种siRNAs均显著抑制8988T PDAC细胞的非凤尾鱼依赖性生长，但不抑制H460细胞。直方图显示了相对于对照的定量。误差线代表三倍。(D类)ATG5的两个shRNAs（HP2和HP7）抑制ATG5表达。(电子)ATG5 shRNAs减少8988T PDAC细胞的软琼脂生长，与击倒效率相对应。显示的结果来自三个独立的实验，一式三份。星号显示与对照组相比在统计学上显著下降(P（P）<0.05 byt吨-测试）。
图5。
图5。
PDAC中的ROS调节自噬。(A类)左边该面板显示8988T细胞经CQ（25μM）处理后抑制自噬，并用DCF-DA染色，通过FACS测量荧光来确定ROS水平。请注意，CQ处理后荧光增强表明ROS水平更高（蓝色曲线）。这个正确的面板显示，当ATG5的siRNA抑制自噬时，ROS也有类似的增加。(B类)通过CQ治疗抑制自噬增加线粒体ROS，如增加的MitoSOX染色所示。(C类)用3 mM NAC处理8988T PDAC细胞可减少基础自噬，表现为GFP-LC3标记的自噬体消失，且在细胞内仅出现弥散信号顶部面板。下面，直方图显示了这些结果的定量，以自噬细胞的百分比表示。星号表示差异具有统计学意义(P（P）经Fisher精确检验<0.05）。(D类)用NAC处理Panc1细胞可减弱类似于8988T细胞的基础自噬。直方图在下面显示了分析的定量，星号表示与Fisher精确检验的对照相比，在统计学上显著减少(P（P）< 0.05). (电子)0.5 mM过氧化氢（H2O（运行）2)导致自噬显著增加，表现为GFP-LC3自噬体显著增加（星号显示与Fisher精确测试的对照相比存在显著差异；P（P）< 0.05). （HBSS）Hank的缓冲盐溶液（血清和氨基酸饥饿）作为自噬诱导的对照。
图6。
图6。
(A类)CQ抑制8988T PDAC细胞自噬导致DNA损伤增加。这个顶部面板显示了来自表达GFP-53BP1融合构建体的细胞的结果。注意CQ治疗的关注度增加，表明DNA DSB增加。与NAC同时治疗缓解了这一情况。直方图在下面显示了代表性分析的定量，其中一个星号表示与对照组相比的统计显著性，一个双星号表示与CQ治疗组相比的统计学显著性(P（P）<0.05费希尔精确试验）。(B类)使用两个siRNAs对ATG5（siA和B）的自噬抑制增加了DNA DSB，用53BP1焦点（木炭棒）测量，并用>10个焦点的细胞百分比表示。单个星号表示与对照组相比，53BP1病灶的增加具有统计学意义(P（P）<0.05费希尔精确试验）。浅灰色条显示了NAC在特定实验中对53BP1病灶的影响。双星号表示与相应的未处理细胞（木炭棒）相比，病灶在统计学上显著减少，表明NAC抑制了自噬抑制引起的DNA损伤。(C类)用CQ处理8988T PDAC细胞，并进行中性彗星试验以测量DSB的数量。数据表示为平均尾部力矩（尾部力矩是尾部长度乘以尾部DNA的百分比）。注意，与对照组相比，CQ治疗后的增加（星号表示有统计学意义；P（P）<0.05到t吨-测试）。(D类)对转染对照siRNA（木炭条）或siRNA至ATG5（浅灰色条）的8988T细胞进行克隆形成存活分析，结果表示为相对于对照的存活分数。注意RNAi抑制自噬后存活率显著降低。在存在1 mM NAC的情况下进行相同的分析，以抑制ROS。这导致ATG5抑制细胞的存活率增加，表明NAC对其进行了部分挽救。(电子)用CQ处理8988T细胞，观察细胞增殖情况。伴随NAC治疗，生长强劲增长。
图7。
图7。
PDAC代谢被自噬抑制所改变。(A类)氧化磷酸化，通过8988T PDAC细胞的耗氧量测量。（蓝色）对照；（红色）CQ。CQ处理显著降低了根据细胞数量或蛋白质浓度标准化的基础耗氧比（OCR）。数据表示四个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。该图显示了基础线粒体呼吸（3 mM葡萄糖）（箭头）和泄漏（呼吸与线粒体ATP合成无关，2μM寡霉素）（A线）、非线粒体OCR（2μM抗霉素A）（C线）和FCCP后的呼吸（5μM）（B线）。与中相同的实验A类使用ATG5（HP2和HP7）的两个shRNAs进行。这两种shRNAs减少基础氧消耗的作用类似于CQ。数据代表了三个独立实验的平均值。(C类)用CQ处理8988T细胞，测量葡萄糖摄取量并与对照细胞进行比较(左边面板）和乳酸分泌(正确的面板）。注意，CQ抑制自噬的细胞中葡萄糖摄取和乳酸分泌显著增加，表明糖酵解增加。（星号显示统计上的显著变化t吨-测试。）(D类)抑制自噬导致细胞内ATP减少。结果以控制倍数表示，并根据蛋白质浓度进行标准化。数据来自三个独立的实验，误差条代表标准偏差。星号表示与对照组相比在统计上显著下降t吨-测试。(电子)自噬抑制不会导致线粒体质量增加。TOM20或Porin（线粒体蛋白）的Western blotting在所示时间段内，当溶酶体蛋白酶和CQ受到抑制时，没有显示出增加。还使用两种不同的线粒体DNA引物（a和b）通过定量实时PCR测定线粒体质量。所示数据来自两个独立的实验，一式三份。使用核衍生DNA的引物对表达进行标准化，并将其表达为对照的倍数。CQ治疗后线粒体质量没有显著增加。(F类)使用JC1测量线粒体膜电位。解偶联物CCCP作为去极化线粒体的阳性对照顶部该面板显示了一个典型的实验，表明CQ处理后线粒体膜去极化没有增加。图表在下面显示了两个独立实验的数据。(G公司)添加丙酮酸甲酯（MP）可保护PDAC细胞免受CQ的自噬抑制。8988T细胞用指示浓度的MP处理，并随着CQ剂量的增加进行IC50分析。如条形图所示，IC50随着MP浓度的增加而显著增加，表明它可以保护细胞免受CQ的抑制作用。
图8。
图8。
使用CQ抑制自噬可有效抑制PDAC肿瘤在体内的生长。(A类)8988T PDAC细胞作为异种移植瘤生长在裸鼠侧翼。当肿瘤达到0.5–1 cm时，将小鼠分为两个治疗组，每组10只小鼠（PBS或每天腹腔注射60 mg/kg CQ）。胰腺癌生存分析以图形形式描述。（蓝色）对照；（红色）CQ。注意CQ治疗组的生存率增加(P（P）=0.0012（通过对数库测试）。在CQ队列中，超过6个月的时间内，只有一只小鼠死于胰腺癌(B类)每周测量两次肿瘤体积，并绘制肿瘤体积随时间的变化曲线。每条线代表单个肿瘤的生长动力学。（蓝色）对照；（红色）CQ。注意CQ处理的肿瘤在底部图中显示了较慢的生长动力学。在CQ队列中，多发肿瘤已完全消退。(C类)在两个未经治疗的对照异种移植物和两个经CQ治疗的小鼠上进行Western blot。注意p62表达的增加，表明肿瘤中的自噬被成功抑制。显示肌动蛋白在下面作为加载控件。(D类)CQ治疗后不同时间点（第0、1、2和7天）采集的异种移植物的IHC分析。与Western blot分析类似，p62的表达随着时间的推移而增加，与未处理组（第0天）相比，棕色染色更强。(电子)对异种移植物进行IHC，以评估γH2AX的表达，这是DNA损伤的标志物。棕色核染色显示，这种表达在CQ处理的异种移植物中高度上调，表明DNA损伤增加。这里显示的是一幅典型的异种移植物图像，取自一只接受CQ治疗7天的小鼠或一个未经治疗的对照组。直方图在下面显示了两个对照肿瘤和两个治疗肿瘤的这些结果的定量，显示为每20×场阳性染色细胞的平均数量（每个样本至少统计10个场）。误差线表示标准偏差。(F类)CQ治疗延长了携带Panc1异种移植物的小鼠PDAC-特异性生存期。实验按中所示进行A类，每组10只小鼠。经log-rank检验，存活率差异显著。与10%的对照组相比，60%的治疗组小鼠在90天时存活。(G公司)shRNAs抑制ATG5表达可减少8988T异种移植物的生长。用两种不同的抗ATG5 shRNAs（HP2和HP7）或对照逆转录病毒感染细胞，并注射到裸鼠的侧翼(n个=每组12）。每周测量肿瘤体积。请注意，与对照组相比，音量大幅下降。这在统计上具有显著性t吨-测试HP2与Ctrl（[*]P（P）=0.02）和HP7与Ctrl的强大统计趋势（[^]P（P）= 0.06). (H（H）)CQ治疗可延长Kras驱动的PDAC基因小鼠模型的存活时间。小鼠在8周龄时开始治疗(n个= 8). 生存率与相同基因型的IP PBS治疗对照队列进行比较(n个= 12). 经log-rank检验，存活率差异显著。
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