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.2011年2月1日；124（第3部分）：348-58。
doi:10.1242/jcs.072272。

人类胚胎干细胞神经分化导致ATP需求和线粒体活性降低

马修·J·伯克 1, 亚当·奥尔, Akos A Gerenceser公司, 大卫·T·马登, 凯西·维泰利, 安德热·斯威斯托斯基, Martin D品牌, 曾宪民（Xianmin Zeng）
附属机构

人类胚胎干细胞神经分化导致ATP需求和线粒体活性降低

马修·J·伯克等。 细胞科学杂志. .

摘要

在这里，我们研究了人类胚胎干细胞（hESCs）和hESC衍生神经干细胞（NSC）的线粒体生物学和能量代谢。虽然体内干细胞可能主要依赖厌氧糖酵解来提供ATP，以最大限度地减少活性氧的产生，但我们的研究表明，体外情况并非如此：hESCs通过氧化磷酸化生成约77%的ATP。hESCs分化为NSCs后，相对于糖酵解，氧化磷酸化的绝对速率和重要性都下降。与一组分化细胞类型相比，hESCs中线粒体基因调节器过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子（PGC）-1α、PGC-1β和受体相互作用蛋白140（RIP140）的表达水平与hESCs氧化磷酸化对ATP供应的偏向相一致。ATP需求分析表明，神经干细胞中ATP周转较慢与最需要能量的过程速度较慢有关，但细胞生长速度没有降低。根据电子显微镜和条件培养基分析的证据，这种不匹配可能是由于人胚胎干细胞中大分子分泌率较高所致。综上所述，我们的发育模型提供了对人胚胎干细胞向更静止的体细胞类型的代谢转变的理解，并支持线粒体和分泌物在人胚胎干系统生物学中的重要作用。

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数字

图1。
图1。
人胚胎干细胞显示出高水平的线粒体活性和有氧ATP生成倾向。(一个)用于测量的微分方案。多能性I6 hESCs（i）、多能性I6神经干细胞（NSCs）（ii）和分化的I6 NSCs（D-35）（iii），神经元Tuj-β-微管蛋白染色。还分析了BJ成纤维细胞（HDF）（未显示图像）。(B)在正常化至细胞蛋白水平的粘附培养物上测量耗氧率（OCR）。基本内生利率；寡霉素、ATP合酶抑制率；FCCP，最大解偶联率；以及Rot+Ant A、鱼藤酮和抗霉素A抑制率。(C)根据与呼吸速率同时进行的测量得出的质子生成速率。(D类)氧化磷酸化和糖酵解产生ATP的速率。结果显示为独立实验（hESC，n个=10; NSC、，n个=11; D-35，n个=3; 和HDF，n个=4). 使用Dunnett校正，通过单因素方差分析计算统计显著性*P（P）<0.05, **P（P）<0.01.
图2。
图2。
线粒体含量随人胚胎干细胞分化而改变。(一个)线粒体[细胞色素]的蛋白质印迹c（c）与BJ成纤维细胞（HDF）相比，来自具有相应NSC和分化NSC（D-35）的人胚胎干细胞培养物的全细胞裂解物中的（Cyt C）和VDAC]以及抗氧化蛋白（MnSOD和CuZnSOD）。(B)细胞色素蛋白带定量c（c）和VDAC来自三个独立的裂解物，每个样品均归一化为人胚胎干细胞蛋白水平。结果表示I6和H9线组合数据的平均值+s.d。(C)人胚胎干细胞和分化细胞中每个细胞的mtDNA拷贝数。结果显示H9和I6干细胞系以及HDF的平均值+s.e.m。(D类)mtDNA拷贝数在hESC分化为胚状体或单层期间发生变化。结果显示H9和I6干细胞系中独立实验的平均值+s.e.m。(E类)线粒体体积比测定的共焦图像。钙调素-AM标记细胞质，线粒体标记线粒体。上两个面板显示每个通道的原始图像，下两个面板则显示二进制处理图像，用作计算输入。(F类)共焦成像线粒体体积比定量。数据表示H9和I6干细胞系的至少四个独立实验的平均值±s.e.m。使用Dunnett校正，通过单因素方差分析计算统计显著性**P（P）<0.01.
图3。
图3。
三种代谢主调节器的基因表达谱突出了多能干细胞和其他需要能量的细胞类型之间的相似性。实时反转录-编码PGC-1αmRNA表达的PCR数据(一个)，前列腺素C-1β(B)和RIP140(C)与其他七种原代细胞类型和两种癌细胞系相比，在饲养细胞（MEF）或条件培养基中的Geltrex（GTX）上维持的I6和BG01 hESC系中。HDF，人类二倍体成纤维细胞；HEK，人表皮角质形成细胞；HEMN-LP，人表皮黑素细胞色素沉着；HMVEC，人乳腺静脉内皮细胞；人脐静脉内皮细胞；人肺动脉平滑肌细胞；HMEC，人乳腺上皮细胞，MCF7，乳腺癌细胞系；宫颈癌细胞系HeLa。结果表示2-4个独立RNA制剂的平均值+标准偏差。(D类)实时反转录–胚胎干细胞分化为类胚体或单层时的PCR数据。数据表示两条hESC线路（H9和I6）的平均值。(E类)NSC和D-35细胞相对于其亲代人胚胎干细胞系的mRNA表达。(F类)在IMR31成纤维细胞重编程为iPSCs并分化为iPSC-NSCs和iPSC-D35细胞期间，mRNA表达发生变化。
图4。
图4。
人胚胎干细胞和分化细胞的静息血浆和线粒体膜电位测定。(一个)在基础条件下，添加K后，用TMRM和PMPI电位探针标记的人胚胎干细胞集落的时间推移图像+平衡鸡尾酒（KEC）和完全去极化鸡尾酒会（CDC）。(B)与A相对应的荧光强度迹线。添加KEC后，按照指示使用KCl基培养基进行顺序替换步骤。最后，添加CDC使质膜完全去极化。(C)在指定的细胞外K下，三种指定细胞类型的平均归一化PMPI荧光值+浓度。(D类)hESC、NSC和HDF（hESC和NSC，n个=8; HDF、，n个=3). 电位来源于补充方法中给出的C。(E类)在基础条件下，添加线粒体去极化鸡尾酒（MDC）和CDC后40秒，用TMRM和PMPI标记的人胚胎干细胞集落的时间推移图像。(F类)如图所示，MDC触发了对应于E.线粒体去极化的荧光强度迹线，最后CDC实现了完全去极化。由荧光痕迹得出的参数如补充材料图S3所示。(G公司)人胚胎干细胞和神经干细胞中典型线粒体的电子显微照片（105000×）。(H（H）)hESCs、NSC和HDF（hESC，n个=28; NSC、，n个=16; 和HDF，n个=13). 电势是根据与F中所示和补充方法中给出的实验类似的实验得出的。使用Dunnett校正，通过单因素方差分析计算统计显著性**P（P）<0.01.
图5。
图5。
人类胚胎干细胞和神经干细胞之间的耗能反应的相对划分在很大程度上保持不变。总呼吸的相对划分如表1所示。
图6。
图6。
人胚胎干细胞和神经干细胞的细胞生成时间。(一个)延时成像下用Hoechst 33342标记的人胚胎干细胞集落。进行有丝分裂或细胞死亡的细胞被标记。(B)从I6和H9人胚胎干细胞系的单个菌落推导出的人胚胎干系统平均细胞生成时间。(C)I6和H9 hESCs的估计平均（+s.e.m.）细胞生成时间(n个=12个）和NSC(n个=4个）。(D类)24小时内细胞死亡的平均频率（+s.e.m.）。使用学生的t吨-测试**P（P）<0.01.
图7。
图7。
分泌样小泡在胚胎干细胞中是唯一存在的。(一个)I6人胚胎干细胞集落内典型场的透射电子显微照片，大多数细胞内有成簇的分泌囊泡。(B)典型的I6 NSC；在神经干细胞中没有发现类似于hESCs囊泡簇的结构。(C，D类)H9 hESC和I6 hESCs株的hESC分泌敏感区放大率。箭头标记杯状细胞样分泌机制。D组显示，分泌囊泡通常被线粒体和类似多聚体的颗粒包围。v、 分泌囊泡呈膜结合结构，内容物均匀；m、 线粒体；n、 核心。
图8。
图8。
人胚胎干细胞比神经干细胞分泌更多的蛋白质。(一个)从经I6 hESCs或NSC处理10小时的培养基中沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE并用GelCode考马斯兰染色。每次实验中，根据细胞蛋白的数量校正沉淀物质的负载。显示了85μg蛋白质的全细胞裂解物通道。控制车道来自中等或Geltrex降水。凝胶是两个独立实验的代表。(B)使用密度计对总沉淀蛋白进行定量。在对照组中同样可见的55 kDa的强带被排除在量化范围之外。三个独立实验的值为平均值+s.d。使用学生的t吨-测试**P（P）<0.01.
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