人类胚胎干细胞神经分化导致ATP需求和线粒体活性降低

人类胚胎干细胞（hESCs）是一种长期自我更新的细胞，能够在体内分化为任何类型的细胞(汤姆森等人，1998年). 人胚胎干细胞作为体细胞生成的无限来源的潜力，对于下游应用，包括药物测试、疾病建模和细胞替代治疗，具有重大意义(Braam等人，2009年;Desbordes等人，2008年;Han等人，2009年;Kiskinis和Eggan，2010年;Pasier等人，2008年;曾和饶，2008). 此外，这些细胞可能对细胞衰老、癌症和衰老的过程产生见解(曾，2007). 对多能干细胞的生物学有一个更全面的了解，这对于从这些领域中获得最大利益至关重要。

胚胎干细胞来源于胚泡内细胞团的细胞，它们迅速分裂。培养的胚胎干细胞具有形成畸胎瘤的能力和短期生长因子-自主细胞周期，这反映了其具有侵袭性生长的特性(Becker等人，2010年;Blum和Benvenisty，2009年)，尽管不同多能干细胞类型的分裂率不同(Hanna等人，2010年). 成年生物体中的祖细胞，如多能干细胞（NSC），必须具有长期存活和自我维持的独特特性，同时保持典型的静止状态。多功能神经干细胞可以从培养的人胚胎干细胞的纯群体中获得(Reubinoff等人，2001年;Swistowski等人，2009年;Zhang等人，2001年)但人们对它们的生物能量需求以及它们的能量代谢受遗传发育计划约束的程度知之甚少。从多能干细胞到分化进行阶段的转变可能涉及细胞过程能量需求的动态变化，这取决于单个细胞类型的需求。需氧细胞中ATP的生成分为两条主要途径：厌氧糖酵解和线粒体氧化磷酸化。根据能量需求的变化以及限制线粒体活性氧生成的需要，可以预计这两种途径的相对贡献在分化过程中会发生变化。

一些模型表明，无论分化谱系如何，线粒体种群的扩张可能是ESC分化开始时的普遍现象(法丘科·奥利维拉和圣约翰，2009年). 然而，许多信号传递和能量消耗过程可能在向分化状态的早期过渡过程中减少，并且可能不会伴随线粒体扩张(Armstrong等人，2006年;Becker等人，2006年;Efroni等人，2008年;Meshorer和Misteli，2006年). 相比之下，线粒体生物发生在体细胞干细胞分化的某些实例中的证据可能与间充质干细胞分化所报告的获得专门的能量需要过程相一致(Chen等人，2008;Uldry等人，2006年). 线粒体调节的变化也可能由遗传发育程序驱动，反映了体内这些细胞类型的典型能量需求，而不是培养中的能量需求。这为遵循能量代谢的基因调控与生物能量学相结合来阐明线粒体功能变化的不同驱动力提供了理论基础。

在本研究中，我们利用先进的生物能量学技术表征了人胚胎干细胞和神经元分化几个阶段的线粒体功能。我们得出的结论是，hESCs具有较高的线粒体活性，随着分化为NSCs，线粒体生物发生的几个相关参数会不成比例地下降，这与总ATP周转减少、大分子生物合成减少和蛋白质分泌减少有关。

为了研究hESC神经分化的生物能量学，我们检测了hESC(图1Ai)、hESC衍生NSC(图1Aii)神经干细胞分化35天，由>80%的β-Ⅲ-管蛋白阳性神经元组成（称为D-35；图1Aiii)，如前所示(Swistowska等人，2010年;Swistowski等人，2009年). 之前已经证明，这些NSC是巢蛋白和Sox1阳性，并且具有广泛的分化能力(Swistowski等人，2009年). 为了与另一种体细胞类型进行比较，我们选择了一种特性良好的人胎儿-包皮素衍生成纤维细胞系（BJ；称为HDF）。

如前所述，使用Seahorse XF-24细胞外通量分析仪在粘附培养物中测定耗氧率和细胞外酸化率(Gerenceser等人，2009年). 当归一化为细胞蛋白水平时，人胚胎干细胞集落的基础呼吸速率比神经干细胞高1.8倍，比HDF高2.8倍(图1B). 耦合速率（总基本速率减去寡霉素速率，其中寡霉素为ATP合成抑制剂）为111 pmol O₂每分钟每10μg人胚胎干细胞中的细胞蛋白，并降至54 pmol O₂神经干细胞中每分钟每10μg细胞蛋白，表明线粒体ATP输出在从胚胎干细胞向神经干细胞的过渡过程中减少。将来自I6和H9系的hESCs和NSC数据合并，以提高我们最终测定的可靠性（在这些系之间未观察到显著差异）。与亲代神经干细胞相比，神经干细胞分化为D-35细胞导致的呼吸或氧化磷酸化几乎没有变化。此外，与人胚胎干细胞相比，神经干细胞的最大解偶联诱发耗氧率（指示最大呼吸容量）显著降低。细胞外酸化率主要是由于乳酸和碳酸氢盐的产生，当校准为质子产生率时，表明糖酵解率(Wu等人，2007年). 与呼吸相比，神经干细胞的糖酵解速率略有增加，但在D-35细胞中显著下降(图1C). 寡粘蛋白敏感的耗氧率和糖酵解率的绝对定量可转换为ATP生成率，以评估每种细胞类型的相对贡献。使用P/O比2.3将寡粘蛋白敏感的耗氧量转换为ATP生成率(品牌，2005)乳酸生成速率和糖酵解产生ATP的速率之间存在一对一的关系。值得注意的是，hESCs通过氧化磷酸化至少产生77%的ATP，而NSC（55%）和HDF（59%）的这一数值明显更低(图1D，两者都是P（P）与hESCs相比<0.01），但与D-35细胞中的hESCs相似（76%）。中的结果图1D研究表明，人胚胎干细胞比神经干细胞、D-35细胞或HDF具有更快的ATP转换，而这一需求主要是通过人胚胎干系统中更高的氧化磷酸化来满足的。

为了解决hESCs对ATP生成的高氧化磷酸化的明显偏见，我们评估了每种细胞类型线粒体含量的各种参数。Western blots显示，尽管电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）在神经分化后水平保持不变，但细胞色素c（c）神经干细胞中的水平显著降低，但在分化为D-35细胞后再次上调(图2A、B). 重要的抗氧化蛋白锰超氧化物歧化酶（MnSOD）（线粒体）和铜/锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD，胞浆）变化不大（NSC中的MnSOD略有降低），表明细胞抗氧化系统在这些状态之间保持相当稳定。

线粒体DNA绝对拷贝数的量化显示，hESCs富含线粒体DNA，每个细胞约有1200–1500拷贝，而NSC、D-35细胞和HDF每个细胞含有600–1000拷贝(图2C; 值是H9和I6细胞系在每个分化阶段的平均值）。发现第三株人胚胎干细胞株BG01每个细胞约有1200个拷贝。饲养细胞上的hESCs与小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）条件培养基中基质上的hESCs的mtDNA含量没有显著差异（数据未显示）。当电池尺寸归一化时（参见补充材料图S1)，这些值相当于hESCs中mtDNA密度的大约1.5到2倍。在含有灭活血清替代物的培养基中，人胚胎干细胞以类胚体或单层的形式分化，表明mtDNA拷贝数的这种渐进性转变发生在分化过程中，到第12天时，其数量接近于神经干细胞的含量(图2D). 这种模式在B6小鼠ESC分化中被模仿(补充材料图S2).

我们还通过使用活细胞共焦成像体视学测量了用MitoTracker Red和钙调素AM标记的细胞中线粒体细胞器的含量。与呼吸和线粒体DNA含量的分化变化一致，体视学显示线粒体体积密度从hESCs的5.4±0.3%下降到NSC的4.0±0.3%(图2E、F;P（P）<0.01），进一步分化后逆转（D-35:5.9±0.4%）。HDFs的线粒体体积密度与NSCs相似（HDF:4.0±0.2%；P（P）与hESCs相比<0.01）。

为了研究高水平的线粒体活性和分化后线粒体生物发生的变化是否具有潜在的核遗传调控，我们检测了线粒体基因表达的“主调节器”的表达，即转录辅激活子和辅抑制子，它们被认为控制多个下游靶点的表达(Feige和Auwerx，2007年;Handschin和Spiegelman，2006年). 我们测量了编码两个转录辅激活物过氧化物酶体-增殖物激活受体γ辅激活物（PGC）-1α和PGC-1β以及转录辅抑制受体相互作用蛋白140（RIP140）的基因的表达水平。我们首先将人胚胎干细胞与几种体细胞衍生的原代细胞类型和两种癌细胞系进行了比较。与我们的功能观察结果一致，编码PGC-1α和PGC-1β的mRNA在hESCs中的表达程度均高于大多数体细胞类型(图3A、B). 与人胚胎干细胞最相似的细胞类型是黑素细胞（HEMN-LP）和癌细胞系MCF7，其显示编码PGC-1α和PGC-1β的mRNA的高表达。RIP140是一种参与氧化代谢的基因阻遏物，与所有其他细胞类型相比，在人胚胎干细胞中表达较弱(图3C). 在人胚胎干细胞分化为神经干细胞期间，PGC-1α和PGC-1β表达降低，RIP140表达增加(图3D，E). 最近也有报道称，随着人胚胎干细胞胚状体分化，PGC-1α和PGC-1β的表达也发生了类似的变化(Prigione等人，2010年). PGC-1α在分化为D-35细胞时的大量诱导与我们观察到的线粒体生物发生增加以及这些细胞中对线粒体ATP产生的依赖性恢复一致。

为了进一步证实这些基因在人类多能干细胞中的表达模式，我们评估了这些基因在来源于IMR90成纤维细胞的诱导多能干电池（iPSC）中的表达(马里等，2010年). 编码PGC-1β的mRNA受到强烈诱导，而编码RIP140的mRNA在重新编程时受到抑制(图3F). 与我们测量的其他成纤维细胞株相比，PGC-1α在这些成纤维细胞中的表达并未诱导，但已经升高。如前所述，诱导分化为NSC和D-35细胞的iPSC(Swistowski等人，2010年)显示出与hESC分化相似的mRNA表达变化(图3F).

最后，我们试图通过稳定过度表达PGC-1β或减少I6 NSC或HDF中RIP140的短发夹RNA（shRNA）来控制分化细胞的能量供应。令人惊讶的是，这两种操作都没有显著提高线粒体呼吸或呼吸能力(补充材料图S3). RIP140基因敲除确实微妙地增加了两种细胞类型的最大呼吸能力，并刺激了神经干细胞的糖酵解。这些发现表明，单独操纵这些基因不足以改变这些细胞类型的线粒体生物能量学。

hESCs较高的基础ATP周转率和最大ATP生成能力不能仅用这些细胞中线粒体的丰度来解释。线粒体膜电位（Δψ_米)占用于驱动ATP合成的质子动力的大部分，因此对ATP的最大生成能力有重大影响(Nicholls，2006年). 静止Δψ_米反映了供应（底物和末端氧化）和需求（ATP消耗）之间的平衡。hESCs中ATP的高需求可能会超过供应，从而导致Δψ较低_米而分化细胞如NSC和HDF的ATP需求较小。相反，来自Δψ的高ATP供应_米可能会使hESC的ATP消耗速度更快。

Δψ_米用荧光显微镜检测hESCs及其相关品系的贴壁培养。所有已知Δψ_米测量技术（荧光、伏安或同位素）依赖于亲脂阳离子的电位依赖性分布，例如荧光指示剂四甲基罗丹明甲酯（TMRM）。这些阳离子的线粒体积累是Δψ的函数_米、质膜电位（Δψ_对)线粒体基质与细胞体积比(Nicholls，2006年). 预计这些参数在不同的单元类型之间会有所不同。揭开Δψ_米, Δψ_对随后使用亲脂性阴离子质膜电位指示剂（PMPI）(Nicholls，2006年)，并分别测定体积比。实时监测整个显微视野的TMRM和PMPI荧光，Δψ_对和Δψ_米考虑到这些探针（A.A.G.和M.D.B.，未出版）的慢电位依赖性重新分布和能斯特行为，通过对荧光强度时间间隔进行时间反褶积，以毫伏为单位进行测定。

Δψ_对通过建立K值进行校准⁺-平衡电位{由细胞内外（EC）控制的电位[K⁺]}用K鸡尾酒⁺-通道开启器并以[K为单位逐步递增⁺]_{电子计算机}(图4A-C). 静止的Δψ_对从两条hESC线路（I6和H9）以及HDF汇集的数据如所示图4D线粒体-基质-细胞-体积比是线粒体-细胞-容积比（见上文）和基质-线粒体-体积比的乘积。后者通过透射电镜体视学测量为基质的体积密度，hESCs为0.84，NSC为0.76。对于HDF，我们假设与NSC的比率相同。有趣的是，人胚胎干细胞中的线粒体大多是“正统”构象(哈肯布鲁克，1966年)而NSC表现为“浓缩”构象，基质中电子密度较高，嵴扩张较多(图4G). 静止Δψ_米根据急性完全线粒体去极化后TMRM的流出动力学计算(图4E、F). 在这些条件下，TMRM荧光的衰减由之前的静息Δψ确定_米体积比和当前Δψ_对（见补充方法）。

平均测定值如所示图4H我们得出结论，Δψ没有显著变化_米将人胚胎干细胞分化为神经干细胞。因此，与hESCs相比，NSCs的呼吸减少不是由ATP供应或需求的大幅减少引起的；相反，通过协调一致的监管，供需保持平衡。

我们的数据表明，人胚胎干细胞比分化细胞更快地转换ATP。为了明确ATP需求增加的原因，我们编制了hESC和NSC ATP需求的完整预算。个别ATP消耗过程被严重抑制，导致ATP需求量相应下降，并触发呼吸成比例下降。蛋白质翻译抑制剂环己酰亚胺、DNA和/或RNA合成抑制剂放线菌素D和蛋白酶体抑制剂MG132的剂量-反应曲线如所示补充材料图S4此外，微管蛋白和肌动蛋白的转换以及Na的活性⁺/K（K）⁺-ATP酶、内质网和质膜钙²⁺-研究了ATP酶和黄嘌呤氧化酶。使用每种抑制剂的最小饱和浓度，对这些细胞总呼吸的相对贡献被累计分配给每个过程(表1;图5). 这些过程的抑制导致两种细胞类型的耗氧率都有明显下降，钙离子除外²⁺-ATP酶和黄嘌呤氧化酶。这些过程的相对需求基本保持不变，蛋白质合成和DNA和/或RNA合成仍然占两种细胞线粒体呼吸的大部分。然而，对蛋白质合成、DNA和/或RNA合成和钠的抑制敏感的绝对耗氧率⁺/K（K）⁺-人胚胎干细胞的ATP酶显著高于神经干细胞，表明这些过程消耗的ATP比神经干细胞多。

我们考虑了人胚胎干细胞和神经干细胞之间细胞分裂率的差异可能是ATP周转率中观察到的一些差异的原因。因此，生成时间是通过延时成像确定的。令人惊讶的是，NSC的生成时间明显短于hESCs（H9 hESCs为20.3小时，NSC为14.2小时；I6 hESC为24.2小时，NSCs为14.1小时）(图6A–C;补充材料电影1). hESCs和NSC之间的细胞死亡率没有显著差异(图6D). 总之，人胚胎干细胞ATP周转率较高不能用较高的增长率来解释。相反，必须增加消耗ATP比例与低增长率相同的过程；这些可能包括自噬或大分子分泌。

电子显微镜显示，人胚胎干细胞中有大分子分泌的标志，而神经干细胞中没有(图7A、B). hESCs通常包含单膜结合的囊泡簇，囊泡含量均匀，核心电子密度较低(图7A–D). 虽然没有观察到明确的细胞外事件，但电子显微镜表明存在杯状细胞样分泌机制(图7C)，这得到了先前显示hESC条件培养基蛋白质组中胞浆和细胞骨架蛋白分泌的结果的支持(LaFramboise等人，2010年). 相比之下，自噬的证据并不常见，但这两种细胞系都含有大的多泡体，表明存在异噬现象。为了直接评估蛋白质分泌的相对速率，我们分析了由hESCs和NSC调节10小时的培养基，发现hESCs调节的培养基中分泌的蛋白质浓度明显较高(图8).

因此，人胚胎干细胞的高ATP生成率可能需要通过一种杯状细胞机制来支持大分子分泌过程中的RNA合成、蛋白质合成、离子泵和细胞骨架重排，在这种机制中，细胞的大部分，包括细胞溶质和细胞骨架成分，都是分泌的。

据我们所知，这是关于人类胚胎干细胞分化的生物能量学的首次报道。我们的主要发现是，人胚胎干细胞保持着较高的线粒体氧化磷酸化速率，这为其对生长以外的过程的高ATP需求提供了资金。我们报道了一种差异，即在从hESCs向NSCs的转变过程中，能量转换的减少伴随着细胞分裂速率的增加，这可能是由hESCs中的大分子分泌来解释的。

与体细胞祖细胞相比，ESCs在体内具有根本不同的生物学作用，体细胞祖细胞可以长时间保持静止。这些细胞类型将在生物能量上调整为正常的发育角色，这似乎是明智的。通过使用一个能够测量正常贴壁培养物中耗氧率和糖酵解率的新型实验平台，我们发现，与由hESC衍生的NSC相比，hESCs的氧化磷酸化率升高，但糖酵化没有增加。与NSC和HDF相比，我们研究的人胚胎干细胞系的线粒体生物发生率相对较高(图2)总的来说，我们的数据支持一个模型，即线粒体生物发生在从hESCs向早期祖细胞的转变时减少，但在分化为更专业的细胞类型时再次增加，例如本研究中检测的神经元种群。线粒体生物发生的变化与分化过程中氧化磷酸化对ATP输出的贡献变化有关。线粒体DNA和细胞色素的丰度表明，较高的基质与线粒体、线粒体与细胞体积比以及较多的呼吸复合物可能导致人胚胎干细胞的最大呼吸能力较高c（c）其他研究提供的数据表明，在血清存在下分化的混合细胞群体中，在hESC分化过程中，线粒体含量的一些指标可能总体增加(Armstrong等人，2010年;Saretzki等人，2008年). 这可能反映了在血清中对其他细胞类型（如心肌细胞）的优先诱导，但根据全细胞荧光测量很难得出结论，因为细胞大小以及线粒体和质膜电位的变化会影响这些读数（参见图4D). 我们在本研究中表明，在纯人胚胎干细胞源性神经干细胞群体中，线粒体含量和活性与母细胞相比有所降低。需要进一步研究以评估其他细胞系中的线粒体和生物能量变化。然而，心脏分化模型的初步数据表明，与非搏动细胞相比，搏动细胞具有独特的线粒体发育（M.J.B.，未发表），进一步强调了研究纯细胞群的重要性。

从这些观察结果中，我们推断hESCs可能具有促进其高线粒体活性的遗传程序，并确定了与“主调节因子”PGC-1α、PGC-1β和RIP140的表达模式一致的表达模式。PGC-1辅活化子在其他模型中已被广泛研究，并被证明是线粒体基因表达的有效调节器(Arany等人，2007年;Fritah等人，2010年;Lelliott等人，2006年;Lin等人，2003年;Meirhaeghe等人，2003年;Powelka等人，2006年;Seth等人，2007年). 我们观察到hESCs和有趣的是，在癌细胞系MCF7中，编码辅活化因子PGC-1α和PGC-1β的mRNA表达水平较高，这表明能量代谢中存在潜在的共性。据报道，MCF7细胞通过氧化磷酸化获得80%的ATP(Guppy等人，2002年). 几乎所有其他研究的初级体细胞类型都显示编码PGC-1α和PGC-1β的mRNA表达减少，同时编码辅加压素RIP140的mRNA的表达增加。最近的出版物通过显示与线粒体生物发生有关的许多其他基因，包括编码线粒体DNA转录因子TFAM和线粒体RNA聚合酶POLRMT的基因，也在hESC和iPSC分化时下调来支持这些观察结果(Armstrong等人，2010年;Prigione等人，2010年). 这些表达变化是作为一种分化程序发生的，还是作为对能源需求减少的响应而发生的，仍然是一个尚未回答的问题。据报道，通过线粒体解偶联增加成纤维细胞的能量需求可以诱导PGC-1辅活化子(Rohas等人，2007年). 如果分化早期能量需求下降，PGC-1辅活化子的表达水平可能会降低。然而，当我们看到PGC-1α强烈诱导神经干细胞的神经元分化时，ATP需求没有任何增加，并且回归到对氧化磷酸化生成的ATP的依赖，发育遗传程序也可能是这两种转变的驱动力。在NSCs和HDFs中操纵PGC-1β或RIP140不足以驱动生物能量学的变化，因此其他基因可能会反对或限制它们在这些细胞中的作用。

线粒体膜电位的测量表明，人胚胎干细胞和神经干细胞具有相似的Δψ_米约为−130 mV。在缺乏明显不同的线粒体膜电位的情况下，人胚胎干细胞的低聚肌球蛋白敏感性呼吸速率较高，表明ATP供应和需求过程的速率平行增加。对需求和供应的协调监管可能有利于避免Δψ的增加_米以及活性氧生成的相关增加(品牌，2010;墨菲，2009). ATP预算的分解表明，在人类胚胎干细胞和神经干细胞中，ATP的消耗途径基本相同。蛋白质和核酸合成一起占能量预算的最大部分（人胚胎干细胞占41%；神经干细胞占线粒体呼吸的52%），表明大多数ATP驱动大分子合成。由于hESCs的总能量预算大于NSC，这表明hESCs中的大分子合成速度更快；然而，在没有细胞分裂增加的情况下，这些额外的大分子最终必须被降解或分泌。研究表明，人胚胎干细胞能够分泌多种化学因子、细胞因子、生长因子和基质重塑酶，以及细胞溶质和细胞骨架成分(Bendall等人，2009年;LaFramboise等人，2010年). 我们发现，人胚胎干细胞具有杯状细胞样分泌的形态学特征，与神经干细胞相比，其向细胞外环境分泌的蛋白质明显更多。需要进一步研究来探讨这种分泌活动的重要性。分泌可能是提高生物合成速率的驱动力；然而，在没有快速分裂的情况下，生物合成速率的提高也可能驱动分泌，而不是增加细胞大小。Sathananthan及其同事也观察到杯状细胞样的hESCs(Sathananthan等人，2002年). 众所周知，人胚胎干细胞的分裂速度相对较慢，比小鼠胚胎干细胞慢得多，因此，在人胚胎干系统中，分裂速度可能无法与驱动生物合成的程序同步，但这一假设需要进一步研究。像c-Myc这样的强效癌蛋白的表达是ESCs的一个特征，可能是此类程序的一个例子。Myc本身是核糖体生物生成和蛋白质合成的重要调节器，也是线粒体活性和生物生成的调节器(Fan等人，2010年;Kim等人，2008年;Li等人，2005年;van Riggelen等人，2010年). 最近的研究也强调了ESCs中生物合成和能量代谢的重要性(Dejosez等人，2010年;Wang等人，2009年).

总之，我们提供了我们认为是第一个证据，证明人胚胎干细胞中许多细胞过程的能量需求相对于其分裂率有所增加，并且主要由线粒体氧化磷酸化生成的ATP提供资金。体外研究的几个物种的胚胎发育显示，胚泡期的耗氧量大幅增加，在此期间蛋白质合成速度最快，据估计，大多数ATP来自于此阶段的氧化磷酸化(Houghton等人，1996年;Sturmey和Leese，2003年;汤普森等人，1996年). 在这方面，人胚胎干细胞可能反映了发育中胚泡细胞在这一重要扩张阶段的代谢特征。

hESC线I6、H9和BG01按照前面所述进行维护(Zeng等人，2004年)或生长在Geltrex涂层培养皿（1:50）（Invitrogen，Carlsbad，CA）上，培养基与之前在灭活小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上调节24小时的培养基相同。B6小鼠ESCs在相同的无条件培养基中生长，但补充有1000单位/ml白血病抑制因子（LIF）（Millipore）而不是成纤维细胞生长因子2（FGF2）。为了分化人胚胎干细胞，用胶原酶IV（1 mg/ml）分离菌落，研磨并悬浮为类胚体长达16天，或在Geltrex涂层培养皿上重新镀膜长达12天，均在不含FGF2的标准ES培养基中。mESCs在无LIF的标准ES培养基中分化为类胚体。

如前所述进行NSC衍生、培养和分化(Swistowska等人，2010年;Swistowski等人，2009年). H9 hESC衍生的NSC来自Millipore。BJ成纤维细胞来自ATCC，生长在含有丙酮酸钠和L-谷氨酰胺（Invitrogen）以及10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的高糖Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。用于RNA表达分析的所有其他细胞类型均来自Invitrogen，并在RNA分离之前使用制造商推荐的培养基进行短暂培养（有关详细信息，请参阅补充材料表S1).

为了计算细胞生成时间，在接种后24小时，在含有5%CO的加湿室中使用相控显微镜对神经干细胞进行成像₂，间隔4分钟，持续8小时。播种后24小时，用2μg/ml Hoechst 33342（分子探针H3570）标记人胚胎干细胞，每隔8分钟以最小激发强度记录荧光图像24小时。从多个区域随机选择细胞，通过眼睛追踪，并记录分裂或死亡事件。计算平均世代时间和死亡频率。

为了对条件培养基进行分析，I6 hESCs或NSC在Geltrex涂层的6 cm直径培养皿上在上述正常生长培养基中高密度生长，冲洗两次，然后在DMEM中与火腿F12和谷氨酰胺孵育10小时。收集后，离心培养基以去除碎片，并分别使用培养基、丙酮和三氯乙酸的1:8:1比例在−80°C下沉淀蛋白质组分1小时。在18000下离心沉淀克在4°C下保持15分钟，并重新悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中，缓冲液的体积与从培养皿中获得的细胞蛋白的相对数量成正比。用含有蛋白酶抑制剂的哺乳动物蛋白提取试剂（皮尔斯）鸡尾酒（罗氏）从单层细胞中制备总细胞裂解物。根据双缩脲法定量细胞裂解物蛋白水平，并用GelCode考马斯亮蓝染色（Thermo Scientific）在测试凝胶上进行确认。沉淀样品与蛋白裂解物一起进行SDS-PAGE，并如上所述进行染色。扫描凝胶，在ImageJ软件（NIH）中使用密度测定法定量车道强度。

使用Seahorse XF-24分析仪测量粘附细胞的呼吸和酸化率（马萨诸塞州北比勒里卡市SeahorseBioscience）。对于hESCs和NSC，XF24 V7分析板涂有Geltrex（1:50）。测量前约24小时将细胞接种在其正常生长培养基中；NSC以7×10的速度播种⁴每个孔的细胞数和作为菌落的人胚胎干细胞总数约为3×10⁴每个孔的细胞数。在添加有15 mM葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、0.5 mM丙酮酸钠和0.4%BSA的无碳酸氢盐DMEM（Sigma D-5030）中进行检测。在测量之前，将细胞清洗两次并在该培养基中预培养1小时。寡霉素用量为0.2μg/ml；羰基氰化物对-四次注射三氟甲氧基苯腙（FCCP），将hESCs、NSC和D-35s滴定至1.5μM，将HDF滴定至2μM；分别在1μM和2μM添加鱼藤酮和抗霉素A。氧消耗值由XFReader软件1.4版根据3分钟测量循环计算得出，该软件最近进行了修正(Gerenceser等人，2009年). 酸化速率取第二和第三基线读数的平均速率。在测定之后，进行标准蛋白质测定。或者，使用D-35细胞，用4%多聚甲醛固定一些微孔，以进行免疫细胞化学染色，如下所述。

如上所述，使用Seahorse XF-24分析仪测量ATP需求，并向分析培养基中添加10 mM HEPES。记录基础呼吸速率，然后注射选择性抑制剂，并记录接下来2-5分钟的呼吸。减去每个平板上包含的仅车辆对照组的微小变化，得出抑制剂的具体效果。用于每个细胞过程的抑制剂以及测试的浓度包括：蛋白质合成（环己酰亚胺，0.01–50μg/ml）；DNA和/或RNA合成（放线菌素D，0.1–10μM）；蛋白酶体（MG132，0.1–50μM）；微管蛋白动力学（诺卡唑，0.1–50μM）；肌动蛋白动力学（latrunculin A，0.1–3μM）；纳⁺/K（K）⁺-ATP酶（哇巴因，1 mM）；肌浆/内质网钙²⁺-ATP酶（SERCA）（thapsigargin，1-1000 nM）；质膜钙²⁺-ATP酶（PMCA）（氯化镧_三1–4毫微米）；黄嘌呤氧化酶（别嘌呤醇，10–1000μM）。如上所述，线粒体呼吸随后被鱼藤酮和抗霉素A完全抑制。除MG132（钙生物化学）外，所有化合物均来自Sigma。

成像是在LabTek I（纽约州罗切斯特Nunc）的8个覆盖玻璃室中进行的。对于hESCs，玻璃上涂有0.1%的明胶，菌落生长在MEF的饲养层上。对于NSC，玻璃上涂有聚鸟氨酸（20μg/ml），然后涂上Geltrex（1:100）。四甲基罗丹明甲酯（TMRM）（7.5 nM；Invitrogen）、质膜电位指示剂（PMPI）（1:200；编号R8042；Molecular Devices的FLIPR膜电位测定试剂盒；加利福尼亚州桑尼维尔）和四苯基硼酸钠（1μM）连续存在于实验缓冲液（120 mM NaCl、1.75 mM KCl、0.2 mM KH₂人事军官₄，10 mM TES，2.5 mM NaHCO_三，0.6 mM钠₂SO公司₄，1.3 mM氯化钙₂，2 mM氯化镁₂，15 mM葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺和0.5 mM丙酮酸钠，pH 7.4）。成像在NIS Elements 3.1（尼康，梅尔维尔，纽约）控制的尼康Eclipse Ti-PFS倒置荧光显微镜上进行，该显微镜配备有S-Fluor 20×/0.75 NA透镜、Lambda LB-LS17光源（萨特仪器，诺瓦托，加利福尼亚州）、级联512B相机（亚利桑那州图森，Photometrics）和MS-2000电动舞台（ASI；尤金，OR）。以nm为单位的激发-二向色镜-发射滤波器组为：PMPI 500/24–520LP（长通）–542/27和TMRM:582–593LP（均来自纽约州罗切斯特市Semrock）–610LP（Omega Optical，Brattleboro，VT）。以10秒的间隔拍摄图像，通常在2–12个阶段位置循环拍摄。建立K⁺平衡电位，添加一种药物混合物（KEC），包括K⁺-通道激活剂：氟哌啶（10μM）、NS309（10μM）和二氮杂卓（100μM）；氯通道共转运抑制剂：R-（+）-IAA94（100μM）、R-（＋）-DIOA（10μM）和布美他尼（80μM）；钠通道抑制剂河豚毒素（1μM）。用于计算Δψ_米用缬氨霉素（1μM）、寡霉素（2μM），FCCP（1μM）和粘噻唑（1μL）的混合物（MDC）使线粒体完全去极化。用离子载体鸡尾酒（CDC）诱导完全细胞去极化：革兰菌素（10μM）、黑精（10μM）、莫能菌素（100μM）和糖酵解抑制剂碘乙酸（500μM）。这种鸡尾酒还包括MDC的成分。Δψ的计算_对和Δψ_米根据测量的荧光强度，按照补充方法进行。

如上所述在LabTek I室中培养细胞，并在上述实验缓冲液中加载钙黄绿素-AM（1μM；Invitrogen）和MitoTracker Red（hESC，50 nM；NSC，D-35和HDF，25 nM；Invistrogen。使用Plan-Apochromat 100×/1.4 NA油透镜记录了分辨率为44 nm/像素的1024×1024像素图像的单平面。用氩488nm和氦氖543nm高强度激光线同时激发钙调素和MitoTracker Red，分别在500-530nm和560nm以上收集荧光发射。为了在不记录光损伤区域的情况下记录连续光学截面，在不同的x个-和年-位置，以及z（z）-平面从培养基底部以1～1.5μm的步长推进到最高焦平面。使用Image Analyst MKII软件（Image Analyst-software，Novato，CA）通过高通滤波和局部自适应阈值对图像进行二值化。为了计算线粒体与细胞体积的比值，线粒体像素的总数除以完整图像集中细胞溶质像素的总数，再乘以0.67，即体视学校正因子(Weibel和Paumgartner，1978年)这解释了线粒体在光学切片上的投影和剪裁。见补充方法。

补充方法中描述了样品制备和处理。为了测定基质体积比，采用均匀随机方法选择线粒体，并在105000倍放大下成像。利用立体调查仪（MBF Bioscience；Williston，VT），利用Cavaileri估计器计算矩阵与整体线粒体体积比。

通过比较线粒体扩增子[人NADH-泛醌氧化还原酶链1（ND1）；小鼠细胞色素]的PCR扩增来评估线粒体DNA绝对拷贝数b条]使用Qiagen DNA迷你试剂盒从DNA中分离的核扩增子（人，Δ-和/或γ-珠蛋白；小鼠，胰高血糖素）。引物序列在补充材料表S2和S3通过PCR扩增，DNA模板由跨越每个扩增子的区域组成。稀释倍数为1×10⁸降至1×10⁴用分离的DNA拷贝生成标准曲线进行定量。

使用含有蛋白酶抑制剂的哺乳动物蛋白提取试剂（Pierce）鸡尾酒（Roche）制备总细胞裂解物。使用标准技术运行凝胶和转移蛋白质。抗体为：抗细胞色素c（c）（编号556433，BD Pharmingen）；抗VDAC（编号MSA03，MitoSciences）；抗MnSOD（编号sc-30080，Santa Cruz Biotechnology）；抗CuZnSOD（编号sc-11407，Santa Cruz Biotechnology）。如前所述进行免疫细胞化学和染色程序(Zeng等人，2003年).

使用TRIzol（Invitrogen）分离RNA，并用DNase-I（Sigma）处理。cDNA是使用Superscript III逆转录酶系统（Invitrogen）合成的。在Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR机器上使用PerfeCTa SYBR Green 2×mix（Quanta Bioscience）进行实时PCR。底漆细节和顺序见补充材料表S4和S5.

从Open Biosystems（克隆ID:40146993）获得编码PGC-1β的cDNA，并克隆到pLenti CMV/TO Neo载体（Addgene:17292）中。靶向RIP140的shRNA通过5′-gcagcagtattcgagaaaGTGTGCTCCttccagaatactgc-3′和反义5′-GCagcagttcgagagaaGGACAGCACTCtcgagaatactgc-3’序列构建，并在pLenti X2 Puro载体（Addgene编号17296）中表达。大写核苷酸表示目标序列。空白pLenti-CMV/TO-Neo载体或抗荧光素酶shRNA（Addgene:21472）用作对照。这种慢病毒系统已经在前面描述过了(Campeau等人，2009年). 所有矢量插入都进行了测序以确认身份。使用人胚胎肾HEK-293FT细胞（Invitrogen）包装慢病毒。使用超速离心法浓缩慢病毒上清液，并使用滴度感染约80–90%的细胞，这是由带有驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达的巨细胞病毒启动子的对照病毒判断的。分析前用新霉素或嘌呤霉素筛选细胞1周。对I6 NSC和HDF进行了两个单独的衍生，用于生物能量分析。

这项工作得到了加利福尼亚再生医学研究所拨款CL1-00501-1（X.Z.）和拉里·希尔布洛姆基金会（X.Z）的支持。RS1-00163-1（D.T.M.，Dale E.Bredesen实验室），美国国立卫生研究院资助PL1 AG032118（A.L.O.，A.A.G.，C.V.和M.D.B.），P01 AG025901，P30 AG025708和R01 AG033542（M.D.B。我们感谢约翰霍普金斯大学的Linzhao Cheng提供iPSC线路。我们感谢马萨诸塞大学的Eric Campeau提供慢病毒载体。存放在PMC中，12个月后发布。