Aldehyde dehydrogenase 7A1 (ALDH7A1) is a novel enzyme involved in cellular defense against hyperosmotic stress

doi:10.1074/jbc.M109.077925

.2010年6月11日；285(24):18452-63.

doi:10.1074/jbc。109.077925美元。 Epub 2010年3月5日。

醛脱氢酶7A1（ALDH7A1）是一种参与细胞高渗应激防御的新型酶

查德·布罗克¹, 娜塔莉·拉森, 蒂亚·埃斯特伊, 阿格拉亚·帕帕, 米里亚姆·坎托雷, Valeria V Orlova公司, Triantafylos Chavakis公司, 凯瑟琳·卡瓦纳, 乌多·奥珀曼, 瓦西里斯·瓦西里欧

附属公司

PMID： 20207735
PMCID公司： PMC2881771型
内政部： 10.1074/jbc。M109.077925

醛脱氢酶7A1（ALDH7A1）是一种参与细胞高渗应激防御的新型酶

查德·布罗克等。生物化学杂志. 2010.

.2010年6月11日；285(24):18452-63.

doi:10.1074/jbc。M109.077925。 Epub 2010年3月5日。

作者

查德·布罗克¹, 娜塔莉·拉森, 蒂亚·埃斯特伊, 阿格拉亚·帕帕, 米里亚姆·坎托雷, Valeria V Orlova公司, Triantafylos Chavakis公司, 凯瑟琳·卡瓦纳, 乌多·奥佩曼, 瓦西里斯·瓦西里欧

附属

¹美国科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多丹佛大学药学系，邮编80045。

PMID： 20207735
PMCID公司： PMC2881771型
内政部： 10.1074/jbc。M109.077925

摘要

哺乳动物ALDH7A1与植物ALDH7B1同源，后者是一种抵御各种形式胁迫的酶，如盐度、脱水和渗透胁迫。众所周知，人类ALDH7A1基因突变会导致吡哆醇依赖性癫痫和叶酸反应性癫痫。在此，我们首次表明，人类ALDH7A1通过产生渗透性物质和代谢有毒醛类来抵御高渗应激。人ALDH7A1在中国仓鼠卵巢细胞中的表达减弱了由细胞外蔗糖或氯化钠浓度增加引起的渗透应激诱导的细胞凋亡。纯化的重组ALDH7A1有效代谢了许多醛底物，包括渗透液前体甜菜碱醛、脂质过氧化衍生的醛和中间赖氨酸降解产物α-氨基己二酸半醛。ALDH7A1的晶体结构支持酶的底物特异性。小鼠组织分布研究显示，ALDH7A1蛋白在肝脏、肾脏和大脑中的表达最高，其次是胰腺和睾丸。ALDH7A1蛋白存在于胞浆、细胞核和线粒体中，在醛脱氢酶中是独一无二的。对人类和小鼠cDNA序列的分析显示，线粒体和细胞溶质转录物在小鼠中以组织特异性方式差异表达。总之，ALDH7A1是一种新型的醛脱氢酶，在多个亚细胞隔室中表达，通过产生渗透压和代谢有毒醛类来保护机体免受高渗应激。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**ALDH7A1在CHO细胞中的表达可防止高渗应激。** A类，来自未转染CHO细胞和稳定转染ΔpCEP4Δ载体（CHO-vector）或ΔpCEP4△-hALDH7A1_v1的CHO细胞系的细胞裂解物（30μg）(*CHO-hALDH7A1号机组*_第1版#13和*CHO-hALDH7A1号机组*_第1版#35)用特异性抗体（如“实验程序”所述）通过Western blot分析检测ALDH7A1蛋白表达；顶部). 重复印迹β-肌动蛋白作为负荷校正。纯化的重组人ALDH7A1蛋白（50 ng）用作阳性对照。B，对细胞裂解物进行AASA活性分析（如“实验程序”所述）。C类和D类，CHO-矢量(*实心圆圈*)和CHO-hALDH7A1_v1克隆35(*开放式圆圈*)用蔗糖处理细胞(C类)或氯化钠(D类)37°C下放置4h，1周后菌落被结晶紫染色。用CHO-Vector和CHO-hALDH7A1_v1克隆35细胞获得的平均菌落数作为未处理对照的百分比进行标准化。E类，CHO-矢量(矢量)和CHO-hALDH7A1_v1克隆35(*ALDH7A1型*)用200或400 m米在37°C下氯化钠4小时。对从未经处理和处理的细胞中分离的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。只有在CHO-Vector细胞中，NaCl促进与凋亡细胞死亡相关的特征性200-bp DNA片段梯状排列(箭头).F类，对HK-2细胞裂解物（20μg）中ALDH7A1敲除的西方分析。用20 n转染细胞米阴性对照或ALDH7A1特异性siRNA。未转染细胞作为额外的阴性对照。再次对斑点进行β-肌动蛋白检测。*G公司*，缺乏ALDH7A1的HK-2细胞的细胞活力降低。用增加的NaCl浓度处理siRNA-转染细胞，并通过MTT分析细胞活力。数值代表平均值±S.E(*误差线*)在三个单独的实验中进行三次(*NS公司*，不显著(第页> 0.05); *,第页< 0.05; **,第页< 0.01).

**图2。**
**人ALDH7A1晶体结构和对接基板。** A类人ALDH7A1亚基A N末端辅因子结合域的α-碳示踪(蓝色)，C末端催化结构域(绿色)和齐聚结构域(红色). NAD分子如所示球体和催化Cys³⁰²如所示*球杆表示法*在两个较大域的界面上。B，active-site pocket的表面表示。*C–E类*是*有色的*根据氮原子类型蓝色，氧气红色，硫*黄色的*和蛋白质碳灰色; 甜菜碱醛立体特写(*BTL公司*；青色碳）(C类)、AASA(*品红色*碳）(D类)和壬醛(不；*黄色的*碳）(E类)停靠到活动站点。方向与中的相同A类.

**图3。**
**小鼠ALDH7A1的组织和亚细胞分布。**从成年C57BL/6J/129/SvJ小鼠中分离出单个器官，并准备用于ALDH7A1表达的Western blot分析（如“实验程序”所述）。A类，ALDH7A1的组织分布。将100 ng纯化的人ALDH7A1蛋白装入*车道1*(*左车道*将从各种组织中获得的30μg蛋白质可溶性提取物加载到每个额外的车道.甘油醛-3-磷酸脱氢酶的相同膜被重新制备(*底部面板*)用于加载校正。B，ALDH7A1在肝脏和肾脏亚细胞组分中的表达通过Western blot分析测定（如“实验程序”所述）。将10μg全细胞或亚细胞部分裂解物加载到每个通道中。用层粘连蛋白B1探测斑点(核)，蛋白质二硫化物异构酶(*微粒体*)，VDAC1(*线粒体*)和GCLM(*细胞质溶胶*)以评估馏分纯度。

**图4。**
**小鼠组织和原发性HUVEC中ALDH7A1免疫化学染色。** A类从C57BL/6J/129/SvJ成年小鼠中分离出心脏、肝脏和肾脏。用免疫前血清孵育5μm切片（按照“实验程序”获得和处理）(顶部)或人ALDH7A1抗体(底部)其次是链霉亲和素结合山羊抗兔IgG二级抗体。放大400倍显示代表性染色模式。箭头所有组织的内皮细胞都有强烈的核染色。此外，在心脏、肝脏和肾脏组织切片中，分别在心肌细胞和肝细胞的细胞核和胞浆以及足细胞细胞核中检测到强烈的ALDH7A1染色(箭头).BHUVEC在培养基中生长，用人ALDH7A1抗体和异硫氰酸荧光素结合二级抗体进行检测(绿色). 细胞核用DAPI染色(蓝色). ALDH7A1染色主要是核染色(箭头). 通过叠加DAPI和ALDH7A1图像来显示共缩放(合并).

**图5。**
**线粒体ALDH7A1转录物的鉴定。** A类，图示鼠标5′端的可选拼接事件*Aldh7a1型*该基因产生两个剪接变体，mAldh7a1_v1和mAldh9a1_v。选择性剪接导致上游AUG的去除，从而阻止线粒体定位信号的翻译。另一个转录物mAldh7a1_v3缺乏mAldh9a1_v中存在的上游外显子，但使用了相同的起始密码子。B，人类*ALDH7A1型*该基因包含两个潜在的翻译起始位点。hALDH7A1_v1和hALDH7 A1_v2已经测序，并利用不同的AUG起始密码子，导致线粒体靶向信号的保留或去除。mAldh7a1_v2和hALDH7A1_v1的上游AUG被预测为非最佳翻译起始位点，这表明翻译起始可能使用“泄漏扫描”机制。迄今为止，尚未在人类中发现mAldh7a1_v1的同源物。两者都有A类和B还包括预测的核本地化和核出口信号。内嵌未按比例绘制(*MTS公司*线粒体靶向信号；*荷兰统计局*，核定位信号；*NES公司*，核出口信号）。C类，使用剪接变种特异性ALDH7A1引物对C57BL6小鼠组织进行RT-PCR。非线粒体转录本由937 bp的上带表示。线粒体转录物由779 bp的低带识别。β-肌动蛋白引物作为阳性对照和负荷对照。D类用含有线粒体信号序列（CHO-hALDH7A1_v1）或空载体（CHO-vector）的人ALDH7A1哺乳动物表达载体转染的稳定CHO细胞进行免疫细胞化学染色。用多克隆人ALDH7A1抗体探测固定细胞，然后用异硫氰酸荧光素结合二级抗体探测(绿色). 用Invitrogen的MitoTracker®Orange CM-H标记线粒体₂TMRos探头(红色). 细胞核用DAPI染色(蓝色). 合并的图像表示强烈的ALDH7A1线粒体定位。

**图6。**
**ALDH7A1在细胞中的拟议作用。**ALDH7A1通过从甜菜碱醛合成保护性渗透压甜菜碱来保护细胞和组织免受渗透胁迫。此外，ALDH7A1可以直接代谢脂质过氧化过程中产生的各种活性醛类，从而加剧细胞内的氧化应激。ALDH7A1还通过AASA转化为氨基己二酸在赖氨酸代谢中发挥关键作用(*美国汽车协会*).

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