A novel sphingosine kinase inhibitor induces autophagy in tumor cells

doi:10.1124/jpet.109.163337

.2010年5月；333（2）：454-64。

doi:10.1124/jpet.109.163337。 Epub 2010年2月23日。

一种新型鞘氨醇激酶抑制剂诱导肿瘤细胞自噬

弗拉基米尔·贝尔扬斯基¹, 克里斯蒂安·克纳克, 查尔斯·德·史密斯

附属公司

PMID： 20179157
预防性维修识别码：项目经理2872961
DOI（操作界面）： 10.1124/jpet.109.163337

一种新型鞘氨醇激酶抑制剂诱导肿瘤细胞自噬

弗拉基米尔·贝尔扬斯基等。药理学实验与治疗杂志. 2010年5月.

.2010年5月；333(2):454-64.

doi:10.1124/jpet.109.163337。 Epub 2010年2月23日。

作者

弗拉基米尔·贝尔扬斯基¹, 克里斯蒂安·克纳克, 查尔斯·德·史密斯

隶属关系

¹美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗莱纳医科大学霍林斯癌症中心药物发现中心，邮编：29425。

PMID： 20179157
预防性维修识别码：项目经理2872961
DOI（操作界面）： 10.1124/jpet.109.163337

摘要

鞘脂神经酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇（S1P）调节细胞信号传导、增殖、凋亡和自噬。鞘氨醇激酶-1和-2（SK1和SK2）磷酸化鞘氨醇形成S1P，将这些脂质的平衡活性转移到细胞增殖。我们以前曾报道过SK活性的药物抑制延缓体内肿瘤生长。目前的研究表明，SK2选择性抑制剂3-（4-氯苯基）-金刚烷-1-羧酸（吡啶-4-基甲基）酰胺（ABC294640）诱导非凋亡细胞死亡，在此之前，微管相关蛋白轻链3断裂，溶酶体形态改变，自噬体形成，A-498肾癌细胞中酸性小泡增多。ABC294640在PC-3前列腺和MDA-MB-231乳腺癌细胞中引起类似的自噬反应。A-498细胞同时暴露于ABC294640和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤，将毒性机制转换为凋亡，但降低了SK2抑制剂的效力，表明自噬是该化合物杀死肿瘤细胞的主要机制。蛋白酶体抑制剂N-（苄氧羰基）亮氨酸基亮氨酸基月桂醛Z-Leu-Leu-al（MG-132）或热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素诱导未折叠蛋白反应在体外协同增加ABC294640的细胞毒性。在携带A-498异种移植物的严重联合免疫缺陷小鼠中，每天服用ABC294640可延缓肿瘤生长并提高自噬标记物，但不会增加肿瘤中由末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记阳性细胞。这些数据表明ABC294640促进肿瘤细胞自噬，最终导致非凋亡细胞死亡和体内肿瘤生长延迟。因此，ABC294640可以有效补充诱导肿瘤细胞凋亡的抗癌药物。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
ABC294640诱导A-498细胞的非凋亡性细胞死亡。A、化学式ABC294640.B，将细胞暴露于指定浓度的ABC29464和24、48或72小时固定。取细胞核，用PI染色，DNA通过流式细胞术分析含量，如下所述*材料和方法*C，细胞暴露于指示浓度的ABC294640持续72 h，用荧光法测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性描述如下*材料和方法*.顺铂(*顺式-*DDP）用作对照（黑条）。数据表示平均值三个实验的±标准误差。D、细胞暴露于ABC294640的指示浓度持续72小时，并用PI和流式细胞术分析前的Annexin-V-FITC，如下所述*材料和方法*。对于每个面板，左下角表示Annexin V-和PI-阴性细胞；右下角表示膜联蛋白V阳性细胞（凋亡细胞）；右上角表示死亡膜通透性为PI（PI阳性细胞）的细胞被膜联蛋白V染色；左上角表示游离核。占总数的百分比单元格显示在每个象限中。

**图2。**
SK抑制剂对A-498细胞LC3裂解和自噬体形成的影响细胞。A、用指定浓度的ABC294640或5处理细胞μM神经酰胺用于指定的时间。LC3-II的产生是通过如下所述的蛋白质印迹进行检查*材料和方法*。通过剥离和重新处理，确认了荷载相等抗肌动蛋白抗体。B、细胞暴露于指示浓度的SKI-2或5μM DMS，LC3裂解由Western评估如下文所述，在24、48或72小时对细胞裂解物进行印迹*材料和方法*C，A-498细胞暴露于载体ABC294640，SKI-2或DMS 48小时，然后固定并免疫染色LC3在下面*材料和方法*.D，LC3-阳性的量化细胞。细胞暴露于50μM ABC294640，30μM SKI-2，或5μM DMS 48小时。数据表示三个样品的平均值±S.E实验。Western blots下面的数字表示相对LC3-II/肌动蛋白比值与载体处理细胞±S.E.的比较。

**图3。**
ABC294640诱导A-498细胞自噬空泡化或凋亡。一个和B，用50μM ABC294640（A）或载体（B）处理细胞24小时后，按照以下说明生成电子显微照片*材料和方法*低倍下的典型显微照片（左，bar=10μm）或高倍率（右侧，bar=0.5μm）显示了细胞的超微结构。箭头表示自噬液泡。用ABC294640或3-MeA单独或在组合72小时，然后处理以分析其DNA含量（C）或caspase 3/7活性（D）如下所述*材料和方法*黑色条表示处理过的细胞中caspase 3/7的活性对于载体，深灰色条代表细胞中胱天蛋白酶3/7的活性用90μM ABC294640处理后，浅灰色条代表半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶用5 mM 3-MeA处理的细胞中有3/7的活性，白色条表示72小时后，用二者处理的细胞中caspase 3/7活性E，A-498细胞单独使用ABC294640（正方形）或DMS（三角形）处理（填充符号）或与5 mM 3-MeA（开放符号）联合48小时，细胞存活率为通过SRB染色进行评估。F、 A-498野生型单元格（填充符号）或SK2shRNA-转染的A-498细胞（开放性标志）用顺铂治疗（循环）或神经酰胺（方格）48小时，并根据标准评估其生存率SRB分析。

**图4。**
PC-3和MDA-MB-231细胞自噬激活。A、 PC3细胞（左侧）或MDA-MB-231细胞（右）用载体或90μM ABC294640处理72小时后，将细胞固定在乙醇中，并用PI染色，通过流式细胞术如下所述*材料和方法*.B、PC3（左）或MDA-MB-231（右）细胞暴露于指示浓度的ABC294640（μM）24小时，然后溶解和免疫印迹。箭头表示LC3-II。C、 PC3（左）或MDA-MB-231（右）细胞暴露于50μM ABC294640 24小时，用MitoTracker绿色和LysoTracker红色染料，共焦成像如下文所述*材料和方法*.

**图5。**
ABC294640对信号通路的影响及ABC29464的联合作用用格尔德霉素或MG-132。A、细胞暴露于指示浓度ABC294640进行48 h，用SDS-PAGE进行分级，并探测指示的蛋白质的Western blotting，如下所述*材料和方法*也显示了Beclin 1在24和72小时的表达。数字下面的蛋白质印迹表明磷酸化蛋白/总蛋白与载体处理细胞的蛋白质比率±标准与处理过的车辆相比，相对beclin-1/actin比率的误差细胞±标准误差。B和C，A-498细胞暴露于仅显示ABC294640（灰色条）、格尔德霉素（B，白色条）、MG-132（C，白色条）或ABC294640和格尔德霉素的组合或MG-132（黑条），72小时后通过SRB试验评估存活率。CalcuSyn为各个组合计算的组合指数（CI）如右图所示。CI值介于0和1之间表示协同作用，CI大于1的值表示对抗。强大的协同作用由接近的值表示到0.*，第页< 0.05.

**图6。**
ABC294640对小鼠肿瘤生长的影响及其组织学特征ABC294640治疗肿瘤。A、雌性SCID小鼠(n个=每组8个）将悬浮在PBS中的A-498细胞皮下注射肿瘤形成后，每天用0(♦) 或50 mg/kg ABC294640(○). 数值代表平均值±S.E.肿瘤体积标准化至每只小鼠治疗第1天。*，第页<0.05；**，第页<0.01. 治疗开始后第27天处死小鼠用福尔马林固定，肿瘤切片进行TUNEL染色LC3和beclin 1的免疫染色如下所述*材料和方法*.B，TUNEL阳性细胞的定量。黑色酒吧代表车辆治疗的肿瘤，白色条代表ABC294640治疗的肿瘤肿瘤。数据表示三个实验的平均值±S.E。C、，ABC294640治疗肿瘤的组织学特征。

**图7。**
ABC294640对肿瘤细胞死亡的反应模型。A、正常生长下条件下，MAPK和Akt通路激活，导致高细胞增殖和低凋亡。有一个基础水平的自噬来提供代谢产物支持细胞的快速增殖和能量需求。B、，暴露于ABC294640后，MAPK和Akt通路下调，从而抑制增殖，减弱对凋亡的限制。同时，ABC294640诱导神经酰胺的产生（通过抑制SK）加速自噬（表现为自噬体生成增加）不可持续的点，导致自噬死亡。C、在3-MeA在场的情况下，自噬被阻断，导致肿瘤细胞凋亡DNA断裂和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活。

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