Overexpressed mitochondrial leucyl-tRNA synthetase suppresses the A3243G mutation in the mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) gene

doi:10.1261/rna.1208808

。2008年11月；14(11):2407-16.

doi:10.1261/rna.1208808。 Epub 2008年9月16日。

线粒体亮氨酸-tRNA合成酶过度表达抑制线粒体tRNA（Leu（UUR））基因A3243G突变

惠城公园¹, 埃德加·戴维森, 迈克尔·P·金

附属机构

PMID： 18796578
预防性维修识别码：第578859页
内政部： 10.1261/rna.1208808

线粒体亮氨酸-tRNA合成酶过度表达抑制线粒体tRNA（Leu（UUR））基因A3243G突变

惠城公园等。核糖核酸。 2008年11月。

。2008年11月；14(11):2407-16.

doi:10.1261/rna.1208808。 Epub 2008年9月16日。

作者

惠城公园¹, 埃德加·戴维森, 迈克尔·P·金

隶属关系

¹美国宾夕法尼亚州费城托马斯·杰斐逊大学生物化学和分子生物学系，19107。

PMID： 18796578
预防性维修识别码：项目经理2578859
内政部： 10.1261/rna.1208808

摘要

人类线粒体tRNA（Leu（UUR））基因中的A3243G突变导致了许多人类疾病。这种突变降低了氨酰化tRNA（Leu（UUR））的水平和分数，并消除了反密码子摆动位置的核苷酸修饰。这些缺陷与线粒体翻译缺陷有关，导致线粒体翻译产物水平和呼吸链酶活性降低。我们通过过度表达人类线粒体亮氨酸-tRNA合成酶抑制了A3243G突变细胞中的呼吸链缺陷。受抑制细胞的耗氧速率与亮氨酸-tRNA合成酶的水平成正比。白细胞-tRNA合成酶的15倍高水平导致了野生型呼吸链功能。受抑制的细胞使tRNA（Leu（UUR））的稳态水平增加，线粒体翻译产物的稳态水平提高了三倍，但蛋白质合成速率没有高于亲代突变细胞的速率。这些数据表明，A3243G突变的抑制是通过增加蛋白质稳定性实现的。通过增加同源氨酰-tRNA合成酶的稳态水平来抑制tRNA基因突变是潜在治疗人类致病性tRNA突变的模式。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
耗氧速率与线粒体LeuRS蛋白水平成正比。(一个)图中所示为亲本突变细胞系WS227.546（开口三角形）、野生型细胞系WS241（开口圆形）和LeuRS转化子（黑钻石）的耗氧率与LeuRS蛋白水平的关系。得到了LeuRS量与耗氧量之间的线性关系(第页 ²=0.78）。用针对人类线粒体LeuRS的抗体通过Western分析测定的LeuRS相对水平的值，在归一化到为亲代突变细胞测定的水平后获得，该水平的赋值为1。对LeuRS转化子A101和A104进行了更详细的研究。(B)图中显示了转染了针对LeuRS（开环）或非靶控siRNA（黑环）的siRNA的A101细胞的耗氧率与LeuRS蛋白水平的关系。得到了LeuRS量与耗氧量之间的线性关系(第页 ²=0.98）。误差条代表1 SD。

**图2。**
抑制不是由野生型mtDNA引起的。含有tRNA的DNA片段^{亮氨酸（UUR）}从WS241野生型（WT）细胞、亲本突变型WS227.546细胞（MT）和LeuRS转化子A101和A104中扩增出该基因。对237碱基对（bp）扩增片段进行HaeIII酶切，得到野生型mtDNA的199-bp片段、A3243G突变mtDNA的127-bp片段和72-bp片段，以及野生型和A3243G突变mtDNA共有的38-bp片段（图中未显示）。显示了DNA片段的大小。蒸馏水（DW）或ρ未检测到DNA片段⁰143B206电池（206）。A104的DNA片段由于不相等的样品负载而具有稍大的凝胶迁移率。

**图3。**
过度表达的LeuRS增加线粒体tRNA的数量^{亮氨酸（UUR）}但不是氨酰化的比例。(*A、 B*)所示为野生型WS241（WT）、亲本突变型WS227.546（MT）和LeuRS转化子A101和A104中氨酰化tRNA水平的代表性Northern blot分析。在酸性条件下分离线粒体RNA，并通过酸性凝胶电泳从非氨酰化tRNA中分离出氨酰化的tRNA。tRNA的氨酰化和非氨酰化物种^{亮氨酸（UUR）}(一个)和tRNA^赖氨酸(B)通过Northern印迹法检测到。这个顶部每个磷光图像中的带对应于指示的氨酰-tRNA物种和底部带到非氨酰化tRNA物种。(C)所示为氨酰化tRNA分数的直方图^{亮氨酸（UUR）}用于指示的细胞系。转化子A101和A104的值与亲本突变细胞的值没有显著差异(*P（P）*> 0.05). 误差条指示1 SD(*D、 E类*)显示了tRNA稳态水平的代表性Northern blot分析^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^赖氨酸野生型（WT）、突变型（MT）和LeuRS转化子A101和A104。tRNA^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^赖氨酸通过20%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳线粒体总RNA后，通过Northern印迹检测。(F类)所示为tRNA稳态水平定量的直方图^{亮氨酸（UUR）}.tRNA水平^{亮氨酸（UUR）}被归一化为tRNA水平^赖氨酸对于所指示的细胞系。细胞系A101和A104中tRNA的稳态水平高于亲本突变细胞系(**P（P）*< 0.01). 误差条指示1 SD。

**图4。**
受抑制细胞的线粒体翻译率没有增加。(一个)显示了野生型WS241（WT）、突变体WS227.546（MT）和LeuRS转化体A101和A104中线粒体翻译产物的代表性荧光图像。线粒体翻译产物标记有[³⁵S] -蛋氨酸和[³⁵S] -半胱氨酸30分钟或60分钟，线粒体裂解物通过Tricine-SDS 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。(B)图示为线粒体翻译速率的直方图。细胞系A101和A104的线粒体翻译速率与亲本突变细胞系的翻译速率没有显著差异(*P（P）*>0.05）。线粒体翻译率通过测量[³⁵S] 蛋氨酸和[³⁵S] 半胱氨酸并入线粒体蛋白。误差条指示1 SD。

**图5。**
在过度表达LeuRS的细胞中，mtDNA编码蛋白的稳定水平增加(一个)在Western分析所示野生型WS241细胞（WT）、突变型WS227.546细胞（MT）和LeuRS转化子A101和A104分离的线粒体部分时，检测到线粒体DNA编码的COX I和COX II以及核编码的孔蛋白。(B)在对所示野生型WS241细胞（WT）、突变型WS227.546细胞（MT）和LeuRS转化子A101和A104分离的线粒体部分进行Western分析时，检测到mtDNA编码的ND1和核编码的孔蛋白。(C)图中显示了所示细胞中COX I、COX II和ND1的稳态水平，并将其归一化为野生型细胞中的水平。A101和A104细胞的COX I、COX II和ND1的稳态水平高于亲代突变细胞的水平(**P（P）*< 0.02; **:*P（P）*< 0.05). 误差条指示1 SD。

**图6。**
SiRNA敲低过表达的LeuRS导致mtDNA编码蛋白水平降低。所示为转染0.1、0.5或1 nM siRNA至LeuRS和1 nM非靶向控制（NTC）siRNA的A101转化子中LeuRS、COX I、COX II和孔蛋白的稳态水平。

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