线粒体亮氨酸-tRNA合成酶过度表达抑制线粒体tRNA中A3243G突变^{亮氨酸（UUR）}基因

LeuRS转化子中的抑制不是由于mtDNA的改变

在进行其他研究之前，我们确认mtDNA的定量或定性改变与LeuRS转化子A101和A104的抑制无关。我们测定了父母突变细胞和A101和A104线粒体DNA中A3243G突变的水平(图2). 转化子A101（99.8±0.1%）和A104（99.8？.1%）中A3243G突变mtDNA的比例与亲代突变细胞（99.6±0.1%。这些突变水平在随后的实验过程中没有改变（数据未显示）。亲本突变细胞（定义为1）、LeuRS转化子（A101为0.90±0.16；A104为0.83±0.29）和等基因野生型细胞（1.06±0.32）中mtDNA的相对水平也相似。

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图2。

抑制不是由野生型mtDNA引起的。含有tRNA的DNA片段^{亮氨酸（UUR）}从WS241野生型（WT）细胞、亲本突变型WS227.546细胞（MT）和LeuRS转化子A101和A104中扩增出该基因。237个碱基对（bp）扩增片段的HaeIII消化产生对野生型mtDNA特异性的199bp片段、对A3243G突变mtDNA特异性的127-和72bp片段，以及对野生型和A3243G突变mtDNA共同的38bp片段（该图中未示出）。显示了DNA片段的大小。蒸馏水（DW）或ρ未检测到DNA片段⁰143B206电池（206）。A104的DNA片段由于样品负载不均，凝胶流动性稍大。

由于先前在线粒体tRNA中发现了A3243G突变的抑制突变^{亮氨酸（CUN）}基因(El-Meziane等人，1998年)，我们测序了两个mtDNA编码的tRNA^卢A101和A104以及亲代突变细胞中的基因。tRNA序列^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^{亮氨酸（CUN）}每个细胞系的基因都是相同的，序列图谱没有显示出低水平的序列改变。

这些实验表明，LeuRS转化子呼吸链功能的增加并不是由于野生型mtDNA比例增加、mtDNA拷贝数增加或mtDNA-编码tRNA的抑制突变所致^卢基因。

通过降低LeuRS水平逆转A101中的抑制作用

确认LeuRS转化子中耗氧速率与LeuRS水平之间的相关性(图1A)，siRNA降低了A101细胞中LeuRS的表达。初步实验表明，用0.1–1 nM siRNA转染线粒体LeuRS 48小时后，线粒体LeuRSmRNA减少30%–80%。转染后5天内，这些mRNA水平没有显著增加（未显示）。我们用0.1、0.5、1.0 nM siRNA或1.0 nM非靶控siRNA转染A101细胞，并测定其对LeuRS蛋白水平和耗氧速率的影响。转染后5天对细胞进行分析，以尽量减少siRNA处理前合成的LeuRS和mtDNA编码蛋白的贡献，因为一些mtDNA-编码蛋白的半衰期超过100小时(Hare and Hodges 1982年;Grisolia等人，1985年).

在转染抗LeuRS siRNA的A101细胞中，稳态LeuRS蛋白水平根据siRNA的使用量降低了45%–95%。LeuRS的下降伴随着耗氧率的成比例下降(图1B, 25%–75%;第页 ²= 0.98). 当LeuRS水平与突变细胞相似时，抑制作用被完全逆转。LeuRS敲除实验证实，正是A3243G突变细胞中LeuRS蛋白水平的增加导致耗氧量的增加。

高水平的LeuRS增加了稳态水平，但没有增加氨酰化tRNA的比例^{亮氨酸（UUR）}

为了研究抑制机制，我们检测了高水平LeuRS对tRNA稳态水平的影响^{亮氨酸（UUR）}以及氨基酰化的比例。tRNA的分数^{亮氨酸（UUR）}在LeuRS转化子A101（31±4%）和A104（34±6%）中氨基酰化的蛋白没有显著差异(P（P）>0.05）与亲代突变细胞（30±6%）相比(图3A，C). 尽管这些值低于野生型细胞的值（55±5%），但这并不是由于RNA分离或凝胶电泳过程中的脱乙酰化，因为所有细胞都含有类似的氨酰化线粒体tRNA片段^赖氨酸（tRNA的69±3%^赖氨酸氨基酰化在野生型细胞中，在亲代突变细胞中为69±2%，在A101中为67±3%，在A104中为68±4%）(图3B).

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图3。

过度表达的LeuRS增加了线粒体tRNA的数量^{亮氨酸（UUR）}但不是氨酰化的比例。(A、 B类)所示为野生型WS241（WT）、亲本突变型WS227.546（MT）和LeuRS转化子A101和A104中氨酰化tRNA水平的代表性Northern blot分析。在酸性条件下分离线粒体RNA，并通过酸性凝胶电泳从非氨酰化tRNA中分离出氨酰化的tRNA。tRNA的氨酰化和非氨酰化物种^{亮氨酸（UUR）}(A类)和tRNA^赖氨酸(B类)通过Northern印迹法检测到。这个顶部每个磷光图像中的带对应于指示的氨酰-tRNA物种和底部带到非氨酰化tRNA物种。(C类)所示为氨酰化tRNA分数的直方图^{亮氨酸（UUR）}用于指示的细胞系。转化子A101和A104的值与亲本突变细胞的值没有显著差异(P（P）> 0.05). 误差条指示1 SD(D、 E类)显示了tRNA稳态水平的代表性Northern blot分析^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^赖氨酸野生型（WT）、突变型（MT）和LeuRS转化子A101和A104。tRNA^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^赖氨酸通过20%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳线粒体总RNA后，通过Northern印迹检测。(F类)所示为tRNA稳态水平定量的直方图^{亮氨酸（UUR）}.tRNA水平^{亮氨酸（UUR）}被标准化为tRNA水平^赖氨酸用于指示的细胞系。细胞系A101和A104中tRNA的稳态水平高于亲本突变细胞系(*P（P）< 0.01). 误差条指示1 SD。

接下来，我们定量了线粒体tRNA的稳态水平^{亮氨酸（UUR）}来自脱乙酰化tRNA的Northern印迹，并将其归一化为tRNA水平^赖氨酸由相同的斑点确定(图3D，E). tRNA的稳态水平^{亮氨酸（UUR）}亲代突变细胞中tRNA的稳定水平为野生型的53±2%^{亮氨酸（UUR）}在A101和A104中分别为野生型水平的73±7%和67±5%(图3F,P（P）< 0.01). 虽然A101和A104中的高水平LeuRS并没有改变氨酰化tRNA的比例^{亮氨酸（UUR）}tRNA稳态水平的增加^{亮氨酸（UUR）}导致氨酰化tRNA水平增加44%^{亮氨酸（UUR）}在亲本突变细胞中发现的上述每个转化子中。

受抑制细胞的线粒体翻译率没有增加

我们通过分析30分钟或60分钟脉冲标记期间的线粒体翻译来检测LeuRS过度表达对线粒体蛋白质合成的影响(图4). 对于每个细胞系[³⁵S] 被纳入所有mtDNA编码蛋白中的蛋白在至少60分钟内呈线性增加，表明[³⁵S] 30min和60min的掺入率代表线粒体蛋白质合成速率。A3243G突变细胞的线粒体翻译率为野生型细胞的53±9%（30分钟）和61±12%（60分钟）。具有高LeuRS水平和野生型耗氧率的A101和A104细胞的线粒体翻译率与亲本A3243G突变细胞没有显著差异(图4B,P（P）> 0.05). 对于30分钟的标记，A101的翻译率是野生型的70±15%，A104的翻译率为野生型的53±9%。对于60-min标记，A101中的比率为野生型比率的70±7%，A104中的比率是野生型的64±20%。

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图4。

受抑制细胞的线粒体翻译率没有增加。(A类)所示为野生型WS241（WT）、突变型WS227.546（MT）和LeuRS转化体A101和A104中线粒体翻译产物的代表性磷图像。线粒体翻译产物标记有[³⁵S] -蛋氨酸和[³⁵S] -半胱氨酸30分钟或60分钟，线粒体裂解物通过Tricine-SDS 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。(B类)图示为线粒体翻译速率的直方图。细胞系A101和A104的线粒体翻译速率与亲本突变细胞系的翻译速率没有显著差异(P（P）> 0.05). 线粒体翻译的速率是通过测量[³⁵S] 蛋氨酸和[³⁵S] 半胱氨酸并入线粒体蛋白。误差条指示1 SD。

通过检测13个mtDNA编码蛋白的相对翻译率，也计算了线粒体总蛋白合成率。结果与通过定量[³⁵S] 并入所有线粒体蛋白。在亲代突变细胞中，个体平均比率为野生型平均比率的56±16%（30分钟）和67±24%（60分钟）。在A101中，这些值分别为65±20%（30分钟）和67±21%（60分钟）；A104组为54±12%（30分钟）和60±14%（60分钟）。在突变细胞和LeuRS转化体中，大多数线粒体蛋白的相对翻译率在30分钟和60分钟标记的野生型细胞中相同蛋白的翻译率的47%至74%之间。唯一的例外是ND1，其合成率在突变细胞和LeuRS转化子中分别为野生型率的18%（30分钟）和30%（60分钟），以及ATP6，其在60分钟标记中的合成率在野生型、突变和LeuRS转化细胞中相似。mRNA中UUR密码子的数量或分数与其相应蛋白质的翻译率之间没有相关性。

耗氧率的测量

耗氧量为5×10⁶如前所述，用极谱法测量细胞(King等人，1992年). 每个细胞系的比率至少测量两次，使用双样本等方差双尾分布的Student t检验分析LeuRS转化细胞。为了比较LeuRS转化子和对照转化子，使用了双样本不等方差双尾分布的Student t检验。

线粒体DNA分析

如前所述，A3243G突变和野生型mtDNA的组分从从转化子、亲本突变和同基因野生型细胞分离的DNA中进行定量(King等人1992). mtDNA的稳态水平按所述进行定量(金和阿塔迪1989)使用至少两天获得的每个细胞系的四个或五个细胞样本。将M13通用引物引物延伸到从含有mtDNA核苷酸3063–3659的M13克隆mp8.M11中分离出的单链模板上，合成mtDNA探针(King和Attardi 1989年,1993). 使用Typhoon 8600 PhosphorImager和ImageQuant软件（GE Healthcare）对杂交信号进行量化。

tRNA^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^{亮氨酸（CUN）}PCR扩增LeuRS转化子和亲本突变细胞的基因(King等人，1992年;El-Meziane等人，1998年). 分离的PCR片段在托马斯·杰斐逊大学Kimmel癌症中心核酸设施用PCR引物作为测序引物进行测序。

siRNA敲除LeuRS

用针对人类线粒体LeuRS（ON-TARGET）的0.1–1 nM siRNA池转染过表达LeuRS的A101细胞加siRNA用于LARS2号机组：Dharmacon）使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。目标上加来自Dharmacon的siCONTROL在1 nM时用作非靶向对照。总RNA由5×10制成⁵细胞使用RNeasy miniprep试剂盒（Qiagen），包括RNase-free DNase（Qiangen）处理。使用引物对LCF（TCTCAGGTGACCACCATTTCACA）和LCR（AGGGCACAAGCATCCTCAAAC），通过实时qPCR（来自Invitrogen的SYBR GreenER二步法qRT-PCR试剂盒）定量线粒体LeuRS mRNA的水平。TATA-结合蛋白mRNA用作PCR参考[引物对TBPF（GCTCTCATGTACCCTTGCCT）和TBPR（GCACTTACAGGGCATCA）]。实时qPCR分析在ABI PRISM 7000序列检测系统（应用生物系统）上进行。

tRNA体内稳态水平的测定^{亮氨酸（UUR）}和氨酰化tRNA^{亮氨酸（UUR）}

线粒体由5×10制成⁷在pH5.0条件下分离线粒体RNA(Enriquez和Attardi，1996年). 在4°C下，通过6.5%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶（pH 5.0）和循环缓冲液，对每个RNA样品的5微克进行电泳。RNA被电转移到Zeta-probe膜（Bio-Rad）上。体外转录的反义tRNA^{亮氨酸（UUR）}或tRNA^赖氨酸被用作探针(Park等人，2003年). 氨酰化和非氨酰化tRNA的杂交信号^{亮氨酸（UUR）}用荧光成像仪定量。对Northern印迹进行重测序，以确定氨酰化线粒体tRNA的部分^赖氨酸氨基酰化tRNA水平由三个独立的RNA分离物测定，每个RNA制备物至少进行两次Northern分析。数据采用双样本等方差双尾分布Student t检验进行分析。

测定tRNA的稳态水平^{亮氨酸（UUR）}，通过在80°C下在pH 8.5下加热5分钟使总线粒体RNA样品脱酰。样品在室温下通过20%聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶进行电泳，并转移到Zeta探针膜上。tRNA定量^{亮氨酸（UUR）}和tRNA^赖氨酸如上所述执行。统计分析采用双样本等方差双尾分布的Student t检验。

线粒体蛋白质合成分析

如前所述，对mtDNA编码的蛋白质进行代谢标记(Hoffbuhr等人，2000年). 细胞在缺乏蛋氨酸和半胱氨酸且含有100μg/mL依米汀（Sigma）的DMEM中培养以抑制细胞质蛋白合成，并在250μCi的存在下标记30分钟或60分钟[³⁵S] 简易标签EXPRE³⁵S公司³⁵S蛋白标记混合物（>1000 Ci/mmole，Perkin-Elmer）。通过均质和差速离心从标记细胞中分离出线粒体(Hoffbuhr等人，2000年). 蛋白质浓度使用DC蛋白质分析（Bio-Rad）测定。通过10%Tricine凝胶电泳40微克蛋白质(Schager和von Jagow 1987年). 以下金额³⁵使用磷成像仪对S标记的线粒体蛋白质进行定量。线粒体翻译速率由两个独立的蛋白质标记实验确定，每个标记至少使用两个凝胶分析。

这项工作得到了美国国立卫生研究院、肌营养不良协会和美国糖尿病协会的资助。H.P.的部分资助来自国际青少年糖尿病基金会的博士后奖学金。