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比较研究
.2008年7月16日；28(29):7435-44.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0727-08.2008。

Nogo-A和髓磷脂相关糖蛋白对少突胶质细胞成熟和髓磷脂形成的调节不同

文森特·佩内 1, 桑德琳·朱莉, Franziska基督, 勒达·迪莫, 马丁·施瓦布
附属公司
比较研究

Nogo-A和髓磷脂相关糖蛋白对少突胶质细胞成熟和髓磷脂形成的调节不同

文森特·佩内等。 神经科学. .

摘要

Nogo-A是一种最有效的寡突胶质细胞衍生抑制剂，用于损伤的成人中枢神经系统的轴突再生。然而，Nogo-A在发育和健康少突胶质细胞中的生理功能尚不清楚。在本研究中，我们研究了Nogo-A在发育中的视神经髓鞘形成中的作用。通过实时定量PCR，我们发现Nogo-A在分化少突胶质细胞中的表达比主要髓磷脂蛋白MBP（髓磷脂碱性蛋白）、PLP（蛋白脂质蛋白）/DM20和CNP（2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶）的表达增加更快。对Nogo-A缺乏小鼠的视神经和小脑的分析显示，出生后第一个月内，少突胶质细胞分化、髓鞘形成和轴突口径增长明显延迟。Nogo-A和MAG的联合缺失导致更严重的短暂性髓鞘减退。与MAG（-/-）小鼠相比，Nogo-A（-/--）突变体在髓鞘和Ranvier结节的结构中没有出现异常。Nogo-A和MAG的共同结合蛋白NgR1在MAG（-/-）动物中被上调，而Lingo-1，一个共受体的水平保持不变。总之，我们的结果表明，Nogo-A和MAG在体内参与少突胶质细胞成熟过程中的作用是不同的，并且表明Nogo-A也可能影响多发性硬化等病理条件下的髓鞘再分化。

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图1。
图1。
Nogo-A在发育过程中在少突胶质细胞和视网膜神经元中呈负调控。A类qRT-PCR检测视神经髓鞘相关蛋白mRNA的表达。Nogo-A mRNA的升高早于少突胶质细胞其他标记物的升高几天。B类，P3后，在视神经的少突胶质细胞中，Nogo-A的转录物显著增加，但在无少突胶质细胞的视网膜的神经节细胞层中经历了平行的下调。误差条表示SEM。C–F类P8视神经切片的单扫描共焦照片显示，Nogo-A存在于典型的少突胶质束间细胞行中。只有少数未成熟的Nogo-a阳性细胞也显示出L-MAG染色(D类)或用于CNP(G公司)如叠加两个标签所示(E类,H（H），星星）。大多数Nogo-A表达细胞尚未表达L-MAG或CNP染色（箭头）。我通过免疫组织化学，在P1的视网膜神经节细胞层和视神经（ON）轴突中，Nogo-A的信号非常强烈。在成人视网膜中，弱Nogo-A标记仅限于视网膜的最内层。J型单扫描共聚焦显微镜显示P15视神经中Nogo-A（红色）和PLP-GFP（绿色）的双重免疫染色。两种染色的叠加显示了Nogo-A在轴突束中的存在（小箭头），以及Nogo-A和PLP在分化的少突胶质细胞（黄色，大箭头）及其突起中的共表达。K（K）与Nogo-A不同，L-MAG（红色）和PLP-GFP（绿色）仅存在于视神经少突胶质细胞（黄色）中。ON，视神经。比例尺：C–H型，100微米；我，200微米；J型,K（K），50微米。
图2。
图2。
Nogo-A和MAG缺失对视神经少突胶质前体细胞数量和迁移的影响。A类在E17.5和P28之间的少突胶质前体细胞和成熟少突胶质细胞中，用识别Olig2的抗体标记视神经纵切面（10μm厚）。Olig2染色的OPC细胞在E17.5从视交叉（OC）迁移并定植于视神经，直到后期的视神经头（ONH）。插图，WT和DOKO视神经吻侧区Olig2染色的对比检查显示，DOKO的细胞密度在P8低于WT，但在P15没有。B类、WT、Nogo-A视神经Olig2标记细胞密度的定量分析−/−、MAG−/−和DOKO小鼠在P0和P28之间。将细胞的平均密度（平均值±SEM）归一化为视神经表面。在每个时间点，对两到七只动物进行检查。比例尺：A类400微米；嵌入，100μm。
图3。
图3。
Nogo-A和MAG缺陷小鼠的少突胶质细胞分化和髓鞘蛋白合成受损。A类,B类MBP免疫染色显示P8视神经纵切面少突胶质细胞分化(A类)P15小脑(B类). 突变的视神经和小脑MBP的强度明显弱于WT组织。MBP染色在信号仅限于视神经头（箭头）的DOKO组最低，在小脑颗粒细胞层（GCL）和白质中尤其低。C类,D类用qRT-PCR分析视神经和小脑P10处MBP、PLP和CNP的相对mRNA水平。每组至少分析三只动物，一式三份。对于每个髓鞘蛋白，使用GAPDH作为内部标准对mRNA水平进行标准化，并以WT值的百分比表示。髓鞘蛋白mRNA的最显著减少出现在Nogo-A中−/−组织。误差条表示SEM。E类，在P15时，所有三个KO小脑中的MBP蛋白异构体都强烈减少，如Western印迹所示（50μg蛋白/泳道）。在第35页，没有发现差异。比例尺：A类,B类，200微米。
图4。
图4。
Nogo-A和MAG影响视神经轴突的髓鞘形成和生长。A–H在P15和P28，在KO视神经中段用电子显微镜检查轴突的髓鞘化。A–D，在P15，Nogo-A中检测到的有髓轴突少于WT神经−/−和MAG−/−视神经，在DOKO中更少。E–H（E–H），在P28，所有组的有髓轴突密度均增加。我，P15和P28有髓轴突百分比的定量(***第页< 0.001, *第页<0.05，方差分析；N个=3-4只动物/组）。在P15，每组测得的轴突数量在WT中为1178个轴突，在Nogo-A中为1873个轴突−/−MAG−/−中1737个轴突，DOKO中1543个轴突；第28页，WT中1549个轴突，Nogo-A中1869个轴轴突−/−，MAG中的1806个轴突−/−对DOKO中的1570个轴突进行了评估。J型在相同的样品中，测定了轴突管径的光谱。与WT小鼠相比，在P15时，KO神经中的轴突直径剖面转移到较小的轴突尺寸。K（K），Axon口径接近P28的WT值。误差条表示SEM。比例尺：A–H，3微米。
图5。
图5。
MAG中髓鞘结构出现异常−/−和DOKO，但不在Nogo-A−/−第28页的视神经。电子显微镜显示第28页WT和DOKO视神经中有髓轴突。A–C，与WT轴突相比(A类)，许多DOKO轴突(B类,C类)显示异常，如髓鞘流出(B类，箭头），多个髓鞘(B类和轴突周围的髓磷脂致密缺陷(C类，箭头）。D类异常髓鞘轴突的定量包括盲目计数异常髓鞘外流、多髓鞘、髓鞘不紧密、轴突周围间隙细胞质缺乏或过剩。因此，WT中有692个轴突，Nogo-A中有532个轴轴突−/−，MAG中407个轴突−/−随机分析了3～4种不同视神经中DOKO的379个轴突。DOKO视神经异常率（37.9±5.6%）显著高于WT（17.5±3.7%）(*第页<0.05，方差分析）。然而，Nogo-A−/−（12.1±5.6%）和WT或MAG−/−（32.2±6.1%）和DOKO无统计学差异。这表明Nogo-A缺失不会影响髓磷脂结构，DOKO视神经异常升高主要归因于MAG缺失。误差条显示SEM。比例尺：A类,B类，2μm；C类，0.6微米。
图6。
图6。
Nogo-A中Ranvier节点处偏执蛋白和钠通道的分布−/−、MAG−/−和DOKO视神经。A–D，视神经切片在P15处对偏执蛋白/Caspr（红色）和钠通道（NaCh；绿色）进行双重染色。通过共焦显微镜，捕获并合并图像堆栈。A类，野生型视神经显示NaCh簇，通常两侧有两个paranodin/Caspr标记的paranodes。B类，在Nogo-A−/−神经，NaCh/偏执狂组织的模式与WT的模式无法区分。C类,D类相比之下，MAG−/−在较小程度上，DOKO小鼠通常表现出单独的偏执狂和NaCh簇。E类计算偏执型阳性成分在节点、半节点和单个偏执型中的分布。在MAG中−/−视神经，只有～11%的偏执狂被完全组装(**第页<0.01，方差分析），而WT为～42%，Nogo-A为～47%−/−和～25%（DOKO）(*第页<0.05，方差分析）视神经。Paranodin/Caspr簇在MAG中更常见为单一偏执狂−/−（～65%）和DOKO（～52%）视神经，与WT（～38%）和Nogo-A相比−/−（～32%）动物。误差条表示SEM。比例尺：50 mm；16.7μm（插图）。
图7。
图7。
Lingo-1在WT和KO小鼠中的发育时间过程。A类，在无少突胶质细胞的视网膜样本和无神经元细胞体、含少突胶质细胞的视神经中，通过qRT-PCR评估Lingo-1 mRNA的时间进程。在视神经中的P6和视网膜中的P15之后，Lingo-1转录物的数量下降。B类在小脑中，Lingo-1 mRNA在P10时达到峰值，然后下降到成人的低水平。在A类100%，视网膜水平P0；在里面B类，P10值。C类在P10，KO和WT小脑的Lingo-1 mRNA水平没有差异。所有qRT-PCR测量值均使用GAPDH作为内部参考标准进行归一化。误差条表示SEM。D类通过Western blot分析，各组之间的Lingo-1蛋白水平（100μg/lane）无差异。实验重复三次，每组三只动物，并进行实验。
图8。
图8。
在无MAG但无Nogo-A的情况下，NgR1上调。A类，WT小鼠小脑中NgR1 mRNA水平的发展。B类、WT、Nogo-A之间P10 NgR1 mRNA水平的比较−/−、MAG−/−和DOKO。C类，Western blot显示MAG中NgR1蛋白上调−/−以及P15和P35小脑的DOKO样本（100μg蛋白质/车道）。Nogo-A没有变化−/−动物。D类NgR1条带的强度通过密度测定法进行量化，并归一化为GAPDH蛋白。突变体中NgR1的相对量以WT值的百分比表示（虚线）。每个条形图是用三种不同动物/组进行的三次重复实验的平均值（±SEM）。
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