SirT1 inhibition reduces IGF-I/IRS-2/Ras/ERK1/2 signaling and protects neurons

doi:10.1016/j.cmet.2008.05.004

。2008年7月；8(1):38-48.

doi:10.1016/j.cmet.2008.05.004。

SirT1抑制降低IGF-I/IRS-2/Ras/ERK1/2信号传导并保护神经元

李颖¹, 魏旭, 迈克尔·麦克伯尼, Valter D Longo公司

附属公司

PMID： 18590691
预防性维修识别码：项目经理2822839
内政部： 10.1016/j.cmet.2008.05.004

SirT1抑制减少IGF-I/IRS-2/Ras/ERK1/2信号传导并保护神经元

李颖等。单元格元。 2008年7月。

。2008年7月；8(1):38-48.

doi:10.1016/j.cmet.2008.05.004。

作者

李颖¹, 魏旭, 迈克尔·麦克伯尼, Valter D Longo公司

隶属关系

¹美国加利福尼亚州洛杉矶市南加州大学神经科学项目，邮编：90089-2520。

PMID： 18590691
预防性维修识别码：第822839页
内政部： 10.1016/j.cmet.2008.05.004

摘要

众所周知，Sirtuins可以保护细胞并延长寿命，但我们之前的研究表明，酿酒酵母Sir2也可以增加压力敏感性并限制寿命延长。在这里，我们为哺乳动物Sir2同源基因SirT1在神经元对氧化损伤的敏感性中的作用提供了证据。SirT1抑制增加IRS-2的乙酰化并降低其磷酸化；它还减少了Ras/ERK1/2通路的激活，表明SirT1可能通过去乙酰化IRS-2部分增强IGF-I信号。SirT1或Ras/ERK1/2的抑制与抗氧化损伤的抵抗有关。老SirT1缺陷小鼠大脑中氧化蛋白和脂质的标记物减少，但在正常和限制热量条件下，纯合基因敲除小鼠的寿命缩短。这些结果与酿酒酵母和其他模型系统的研究结果一致，表明哺乳动物的sirtuins既可以起到保护作用，也可以起到觅食作用。

PubMed免责声明

数字

图1
抑制SirT1脱乙酰酶可增加神经元的氧化应激抵抗力。皮层神经元在96孔板中培养(一个–E类)或10厘米盘子(F类). (一个,B类,C,D类)用烟酰胺治疗10–14个DIV神经元(**A、 B类**; Nico）或sirtinol(**C、 D类**)在指定浓度下放置48小时。然后用400μM过氧化氢诱导氧化应激(**A、 C类**)或7.5μM甲萘醌(**B、 D类**)分别是。24小时后用MTT法测定细胞活力。ODs被标准化为各自的控件（H₂O（运行）₂/甲萘醌与经车辆处理的对照品有关；H（H）₂O（运行）₂+Nico/sirtinol相对于Nico/sir tinol单独使用；甲萘醌+尼科/西丁诺相对于尼科/西丁诺）。(E类)5个DIV神经元转染对照或SirT1 siRNA。2天后，部分神经元接受H₂O（运行）₂或甲萘醌，24小时后进行MTT分析。(F类)用对照或SirT1 siRNA转染5个DIV神经元，2天后检测SirT1-脱乙酰酶活性。数据表示平均值±SEM。

图2
抑制SirT1脱乙酰酶降低Ras/ERK_1/2培养神经元的激活和体内. (一个)显示SirT1抑制剂sirtinol对Ras活化作用的典型印迹。10–14个DIV神经元用载体或60μM西尔蒂诺处理4小时，然后进行Ras活化分析或用抗Ras免疫印迹。(**B、 C类**)显示SirT1抑制剂烟酰胺作用的典型印迹(B类)和sirtinol(C)在ERK上_1/2发送信号。用Nico处理10–14个DIV神经元48小时或用sirtinol处理4小时。收集总细胞裂解物进行SDS-PAGE并用抗磷酸-ERK进行印迹_1/2和抗ERK_1/2分别是。(D类)定量免疫印迹显示西地诺对ERK的影响_1/2激活。(E类)用U6Pro-SirT1-siRNA+GFP或显性阴性GFP-SirT2（SirT2DN）转染7个DIV皮层神经元，48小时后用抗磷酸-ERK免疫染色_1/2. (F类)分别对12个转染细胞和12个附近未转染细胞的SirT1 siRNA和SirT2DN免疫密度进行量化。(**G、 H）**代表性斑点(**G公司**)和量化(**H（H）**)显示SirT1脱乙酰酶对ERK的影响_1/2小鼠海马区的信号传导。(**一、 J、K、L**)代表性斑点(**I、 K**)和量化(**J、 L（左）**)显示西地诺对ERK的影响_1/2HEK细胞中的信号传导。将HEK细胞在含有0.5%FBS的培养基中饥饿15小时，并用60μM的西地诺培养4小时，然后用IGF-1或PMA处理5分钟。将细胞裂解物进行SDS-PAGE并用抗磷酸-ERK进行印迹_1/2或抗ERK_1/2.量化显示为平均值±SEM。

图3
SirT1在大脑中的亚细胞定位。(**A、 B类**)出生后3天的前脑（P3，一个)和成人(B类)将小鼠匀浆，通过蔗糖颗粒离心分离成核、胞浆和膜组分，并用SirT1、NeuN、GAPDH、GluR进行免疫印迹_2/3分别是。在P3脑中，SirT1定位于细胞核和胞浆中，而在成人脑中主要存在于胞浆中。(C)SirT1免疫印迹的特异性在SirT1-/-小鼠中得到证实。

图4
SirT1调节Ras/ERK_1/2通过IRS-2去乙酰化进行信号传递。(一个)SirT1和IRS-2之间的物理相互作用。用V5-SirT1转染HEK293细胞，48小时后用V5抗体或对照IgG免疫沉淀细胞裂解物，并分别用抗IRS1或抗IRS2探测。(B类)SirT1脱乙酰化物IRS-2在体外HEK细胞裂解物用抗IRS2沉淀，分成3等份，分别与0、1或2μg SirT1脱乙酰酶孵育1.5小时。然后进行SDS-PAGE并用抗乙酰化赖氨酸（AcK）进行印迹。(**C、 D类**)代表性斑点(C)和量化(D类)显示抑制HEK细胞中的SirT1脱乙酰酶可增加IRS-2的乙酰化并降低IRS-2磷酸化，但对IRS-1无影响。(C)按照指示处理HEK细胞，用抗IRS1或抗IRS2沉淀细胞裂解物，并用抗AcK或抗磷酸酪氨酸（PY）印迹。细胞裂解产物也被印迹为IRS1或IRS2。(D类)4-5个斑点的定量（平均值±SEM）。(E类)显示SirT1对神经元IRS-2脱乙酰化作用的典型印迹。用对照或SirT1 siRNA转染5个DIV神经元。2天后，用抗IRS2免疫沉淀细胞裂解物，并对AcK或PY进行印迹。细胞裂解物也对IRS2、P-ERK进行印迹_1/2和ERK_1/2分别为。

图5
抑制ERK_1/2保护神经元免受氧化应激。神经元培养在96个培养皿中(**A、 D、E**)或6孔板中的玻璃盖卡瓦(B类). 用ERK预处理10-14个DIV神经元_1/2抑制剂U0126或SL327持续4小时。H诱导氧化应激₂O（运行）₂或甲萘醌。通过MTT测定存活率(一个)或活/死分析(B类). (C)根据活细胞（绿色）和死细胞（红色）的数量计算活细胞百分比。(**D、 E类**)ERK公司_1/2抑制主要减轻坏死。用对照或SirT1 siRNA转染神经元，或在暴露于400μM H之前用SL327培养神经元₂O（运行）₂或7.5μM甲萘醌。24小时后收集培养液进行乳酸脱氢酶（LDH）检测，并对细胞进行裂解以进行凋亡检测。数据表示平均值±SEM。

图6
减少SirT1−/−小鼠大脑中的氧化应激，缩短SirT1-/−鼠的寿命。(一个,B类)减少SirT1基因敲除小鼠大脑的氧化应激。蛋白质羰基含量(一个; nmol蛋白质羰基/mg蛋白质，平均值±SEM）和脂质过氧化(**B、，**TBARS分析；在18个月大的SirT1+/+和−/-小鼠大脑中测量每mg蛋白质的nmol丙二醛当量。(C,D类)热量限制不会延长SirT1−/−小鼠的寿命。(C)使用ad-lib饮食的SirT1+/+（n=16）、+/-（n=15）、−/−小鼠（n=14）的存活曲线(*P（P）*<0.05，log-rank检验）。(D类)SirT1+/+（n=13）、+/-（n=18）、−/−（n=12）小鼠在40%低热量饮食下的存活曲线(*P（P）*<0.001，log-rank检验）。CR发病时，小鼠的年龄为2-5个月。

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中的注释

西尔图因和衰老的持续传奇。
凯伯林·M·。凯伯林·M·。单元格元数据。2008年7月；8（1）:4-5。doi:10.1016/j.cmet.2008.06.004。单元格元数据。2008 PMID：18590685 审查。

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