CCCTC-binding factor activates PARP-1 affecting DNA methylation machinery

doi:10.1074/jbc.M801170200

.2008年8月8日；283(32):21873-80.

doi:10.1074/jbc。M801170200。 Epub 2008年6月5日。

CCCTC-结合因子激活PARP-1影响DNA甲基化机制

蒂齐亚娜·瓜斯塔菲罗¹, 芭芭拉·塞奇内利, 米歇尔·赞佩里, 安娜·雷尔, 朱塞佩·里吉奥, 奥尔加·斯特汉德尔, 加布里埃拉·祖皮, 莉莉娅·卡拉布雷斯, 保拉·卡亚法

附属公司

PMID： 18539602
PMCID公司：项目经理2494936
内政部： 10.1074/jbc。M801170200型

CCCTC-结合因子激活PARP-1影响DNA甲基化机制

蒂齐亚娜·瓜斯塔费罗等。生物化学杂志. 2008.

.2008年8月8日；283(32):21873-80.

doi:10.1074/jbc。M801170200。 Epub 2008年6月5日。

作者

蒂齐亚娜·瓜斯塔菲罗¹, 芭芭拉·塞奇内利, 米歇尔·赞佩里, 安娜·雷尔, 朱塞佩·里吉奥, 奥尔加·斯特汉德尔, 加布里埃拉·祖皮, Lilia卡拉布里斯, 保拉·卡亚法

附属

¹意大利罗马Aldo Moro广场5号La Sapienza大学细胞生物技术和血液学系，邮编：00161。

PMID： 18539602
PMCID公司：项目经理2494936
内政部： 10.1074/jbc。M801170200型

摘要

我们以前的数据表明，在L929小鼠成纤维细胞中，甲基化模式的控制部分取决于聚（ADP-核糖基）化，而聚（ADP-核糖）化PARP-1和/或无蛋白的ADP-核糖聚合物（PAR）对Dnmt1活性有抑制作用。在这里，我们发现CCCTC-结合因子（CTCF）的瞬时异位过度表达在同一小鼠成纤维细胞中诱导PAR积聚、PARP-1和CTCF多聚（ADP-核糖基）化。高PAR水平在时间上的持续影响DNA甲基化机制；DNA甲基转移酶活性受到抑制，从而导致基因组的甲基化状态，从而导致广泛的低甲基化，影响着着丝粒小卫星和B1 DNA重复序列。体外数据显示，即使在没有刻痕DNA的情况下，CTCF也能激活PARP-1自身修饰。我们的新发现是，CTCF本身能够在体外激活PARP-1自身修饰，这是一个非常有趣的发现，因为到目前为止，在引入DNA链断裂后，普遍发现了聚（ADP-核糖基）化PARP-1的爆发。CTCF不能抑制DNMT1活性，而聚腺苷二磷酸核糖基化的PARP-1发挥了这种抑制作用。这些数据表明，CTCF参与了聚ADP-核糖基化和DNA甲基化之间的串扰，并强调了PARP活性快速逆转的重要性，因为DNA甲基化模式负责重要的表观遗传密码。

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数字

**图1。**
**体内和*在体外*CTCF与聚ADP-核糖基化之间相关性的实验。** *A、，*在转染pCI-CTCF和pCI后24、48和72小时，利用抗ADP-核糖聚合物抗体的SDS-PAGE和Western blot分析来自培养物的核裂解物(标准)并对抗指示的蛋白质。Sp1被用作内源性对照。*B、，*实时RT-PCR第1部分和*第二部分*在转染两种pCI后24、48和72小时对来自细胞的RNA样品进行(*白色条*)和pCI-CTCF(*灰色条*)向量。*Hprt1（小时）*mRNA作为内源性对照。数据报告为*第1部分*或*第二部分*mRNA水平至*Hprt1（小时）*每个样本中的mRNA水平由至少三个重复进行的实验计算得出。pCI样本被视为1.0。*C、在体外*PARP-1活性的测定*bv型*CTCF。通过SDS-PAGE和Western blotting检测PAR的合成。*底部面板*报告CTCF和PARP-1的Western blot分析。*D、，*在存在（×）或不存在的情况下进行的PARP-1放射分析(○）在PJ-34的存在下(▴). 为了排除重组CTCF的聚（ADP-核糖基）化活性，0.4 pmolbv型在聚ADP核糖基化缓冲液中测定CTCF(▵). 数据报告为重复进行的两个实验的平均值±S.E。*E、，*CTCF和PARP-1在核裂解物上的相互Co-IP。正常IgG作为阴性对照。*F、，*下拉分析*bv型*CTCF（His-tagged）和重组PARP-1。

**图2。**
**体内和*在体外*研究CTCF过度表达对DNA甲基转移酶活性的影响的实验。** *A、，*用CTCF、Dnmt1和Sp1抗体作为内源性对照，通过SDS-PAGE和Western blot分析转染pCI-CTCF和pCI后24、48和72小时培养物的核裂解物。*B、，*实时RT-PCRDnmt1型在转染pCI后24、48和72小时对来自细胞的RNA样本进行检测(*白色条*)或pCI-CTCF(*灰色条*)向量使用*Hprt1（小时）*mRNA作为内源性控制。数据报告为以下算术比率的平均值±S.EDnmt1型mRNA水平至*Hprt1（小时）*每个样本中的mRNA水平由至少三个重复进行的实验计算得出。pCI样本被视为1.0。*C、，*pCI-CTCF转染后24、48和72小时培养物核提取物的内源性DNA甲基转移酶活性(*灰色条*)和pCI(*白色条*)向量。pCI样本被视为100%。*D、体外*在bvCTCF含量增加的情况下对重组DNMT1进行活性测定。数据报告添加bvCTCF（•）后DNA甲基转移酶1活性的百分比，*在体外*聚（ADP-核糖基）化PARP-1(▵), PARP-1/DNMT1摩尔比为1时的PARP-1(□），和CTCF洗脱缓冲液（224）。中报告的数据*B–D类*是重复进行的三个实验的平均值±S.E。*E、，*对核裂解物进行Dnmt1和PARP-1的相互Co-IP。正常IgG作为阴性对照。

**图3。**
**DNA甲基转移酶活性抑制对基因组DNA甲基化状态的影响。** *A、，*对用pCI-CTCF转染不同时间（、和72 h）的细胞纯化的基因组DNA进行甲基接受能力测定(*灰色条*)或pCI(*白色条*)向量。结果显示为活动百分比与相对控制值取100。用5-AZA处理的细胞获得的DNA作为基因组低甲基化的阳性对照(*黑色条*). 数据以一式三份的三个实验的平均值±S.E.报告。B类和*C、，*针对小卫星的Southern blot(B类)和B1(C类)在用pCI-CTCF和pCI转染后24、48和72小时纯化的培养物基因组DNA上进行DNA重复，并用HpaII或MspI限制酶消化。从用5-AZA处理的细胞获得的DNA被用作基因组低甲基化的阳性对照。

**图4。**
**CTCF过度表达对PARP-1的影响^–/–PAR水平的细胞、细胞存活率、Dnmt1表达和DNA甲基转移酶活性。** *A、，*L929和A1的核裂解物（PARP-1^–/–)用pCI和pCI-CTCF载体转染细胞后72小时，利用PAR抗体和指示蛋白抗体，通过SDS-PAGE和Western blotting分析细胞。拉明B1被用作内源性对照。*B、，*pCI转染后72小时L929和A1细胞的存活率(*白色条*)和pCI CTCF(*灰色条*)向量。*C、，*pCI转染后72小时L929和A1细胞核裂解物的内源性Dnmt活性(*白色条*)和pCI-CTCF(*灰色条*)向量。中报告的数据B类和C类是三个独立实验的平均值±S.E。

**图5。**
**描述CTCF异位过度表达后细胞内发生事件序列的可能模型。**CTCF激活(*灰色箭头*)PARP-1诱导CTCF和其他核蛋白的自身修饰和聚（ADP-核糖基）化尚待鉴定。PAR在核环境中的持续存在导致Dnmt1活性的“稳定”抑制。修饰的PARP-1与Dnmt1非共价结合，抑制其酶活性，因此，基因组DNA广泛地低甲基化。

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