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.2005年2月；25(4):1511-25.
doi:10.1128/MCB.25.4.1511-1525.2005。

igh位点潜在3'端附近的染色质结构涉及B细胞发育期间组蛋白修饰的模块化调节和CTCF位点的体内占有

弗朗西娜·加勒特 1, 亚历山大·埃梅利亚诺夫, 曼努埃尔·A·塞普尔维达, 帕特里克·弗拉纳根, 萨布丽娜·沃尔皮, 李福斌, 德米特里·卢基诺夫, 劳雷尔·埃克哈特, 维克托·洛巴连科夫, 芭芭拉·K·伯什坦
附属公司

igh位点潜在3'端附近的染色质结构涉及B细胞发育期间组蛋白修饰的模块化调节和CTCF位点的体内占有

弗朗辛·加勒特等。 分子细胞生物学. 2005年2月.

摘要

小鼠Igh基因座在DNase I超敏位点有一个3'调节区（3'RR），包含四个增强子（hs3A、hs1,2、hs3B和hs4）。3'RR通过控制生殖系转录，对几个同型的类开关重组（CSR）产生长期影响。通过使用染色质免疫沉淀法测量乙酰化组蛋白H3和H4以及二甲基化组蛋白H（K4）的水平，我们发现在B细胞发育早期，包含3'RR增强子的染色质开始获得典型的开放构象的逐步修饰。hs4增强子最初与前B细胞和前B细胞中的活性染色质相关，然后与B细胞和浆细胞中的hs3A、hs1,2和hs3B相关。组蛋白修饰在静止的脾B细胞和由脂多糖诱导进行CSR的脾脏B细胞中相似。从原B细胞阶段开始，hs4下游约11-kb区域显示H3和H4修饰，表明染色质开放。该区域包含新发现的DNase I超敏位点和几个CTCF靶点，其中一些靶点在体内以发育调节的方式占据。成熟B细胞延伸的3'RR的开放染色质环境两侧是组蛋白H3的二甲基化K9相关区域。总之，这些数据表明3'RR元件位于一个特定的染色质亚结构域中，该亚结构域包含CTCF结合位点和发育调控模块。

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数字

图1。
图1。
hs4下游区域的DNase I超敏位点。（A） 小鼠示意图伊格该位点显示V、D、J和恒定区基因（实心条）、增强子和DNase I超敏位点（实心圈）。老鼠伊格该位点位于第12号染色体上，由数百个可变（V）基因、16个多样性（D）基因和4个跨越3 Mb以上的连接（J）基因组成。在Cμ和Cα之间，还有额外的恒定区基因：δ、γ3、γ1、γ2b、γ2a和γ。这些数字代表BAC199M11中插入物的位置，单位为千碱基，该插入物开始于Cα基因最后一个外显子的下游。描述了EcoRI（RI）限制酶位点，以及用于DNase I超敏反应分析的HindIII（H3）位点。hs4附近测线上方的水平条表示本研究中使用的PstI-2.3和hs4D探头。PstI-2.3探针检测到约22-kb RI片段（BALB/c），而hs4D检测到约6.6-kb HindIII片段（C57BL/6）。三角形是用于ChIP分析的目标。（B） EcoRI消化来自63-12 pro-B细胞系、18-81 pre-B细胞株、A20成熟B细胞系和2017 pro-T细胞系的DNase I处理细胞核。PstI-2.3检测到的～22-kb片段包括hs4和两个新的DNase I超敏位点hs5和hs6（*），分别位于远端EcoRI位点上游～4.5和3.5 kb。（C） 对来自休息和LPS刺激B细胞的DNase I处理的细胞核进行HindIII消化，发现额外的hs4下游DNase I-超敏位点hs7（*）。
图2。
图2。
AcH3和AcH4在3′RR的发育分析。对MEL细胞系（A）、18-81前B细胞系（B）、A20成熟细胞系（C）和MPC11浆细胞系（D）的染色质进行ChIP分析。无抗体和IgG作为实验对照。β-珠蛋白和CAD（编码氨甲酰磷酸合成酶II的基因[EC 6.3.5.5]、天冬氨酸转氨酶[EC 2.1.3.2]和二氢鸟嘌呤酶[EC 3.5.2.3]）作为阳性对照，Eμ作为MEL细胞系的阴性对照。CAD和β-珠蛋白基因分别用作B细胞组蛋白乙酰化的阳性和阴性对照。使用的引物在相关凝胶旁边标明。所示为用于半定量PCR分析的输入和IP样品的系列（1:3）稀释液。由于技术错误，MPC11输入中hs1、2的信号缺失。
图3。
图3。
AcH3和AcH4在3′端的结合伊格小鼠原B细胞和脾B细胞群以及前B细胞系中的基因座。显示了用抗AcH3和抗AcH4对从RAG1缺陷小鼠（a）、3-1前B细胞系（B）和脾B细胞（C）的骨髓中分离的前B细胞进行的ChIP实时PCR分析。使用的引物显示在柱状图条下方。如材料和方法所述，将数据绘制为免疫沉淀样品中的信号与输入中检测到的信号的数值比较。灰色条带表示从hs3A延伸至hs4的3′RR。
图4。
图4。
扩展3′RR侧翼序列中di-me K4 H3和di-me K9 H3的相互关联，以及di-me K1 H3和di-me K9 H3修饰的实时PCR分析。所示为di-me K4 H3在前B细胞（A）和脾B细胞（B）中的富集，以及di-me K9 H3在A20细胞（C）和脾细胞（D）中的浓缩。
图5：。
图5：。
组蛋白H3和H4乙酰化以及二甲基K4 H3在伊格进行CSR的细胞中的3′RR。在新鲜分离的脾脏B细胞上（A）或在LPS刺激48小时后（B）进行具有AcH3、AcH4和di me K4 H3抗体的ChIP测定。
图6。
图6。
hs4下游地区CTCF站点的识别和分析。（A） 3′RR的标度内示意图显示了用于EMSA的30个连续重叠DNA片段（断续显示片段数）。EMSA确定了与hs4、hs5和hs6下游区域（即hs7）相关的CTCF结合位点。F、 游离DNA探针；C、 用荧光素酶模板控制TnT反应；ZF，CTCF的11锌指区；FL，全长CTCF。（B） 通过使用测量Neo的稳定转染分析评估hs5和含有强CTCF结合位点（hs7）的区域的绝缘体活性对聚居地。在不同的实验中，含有T细胞受体增强子和启动子的构建物检测到的菌落数量在～130到180之间。我们将这个数字设置为100，并相应地对所有其他数据进行了标准化。BB标识BEAD-1绝缘体并用作阳性对照。
图7。
图7。
ChIP分析63-12前B细胞（A）、18-81前B细胞，以及休息和LPS刺激的正常B细胞（C）中3′RR的CTCF结合。上方的水平线x个轴表示正常IgG检测到的最高信号水平。
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参考文献

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