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老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2019年1月31日；11(2): 328–349.
2019年1月18日在线发布。 数字对象标识：10.18632/页码101726
预防性维修识别码：PMC6366960型
PMID：30659163

低密度脂蛋白对低氧诱导的血管生成的损害涉及一个以HIF为中心的信号网络，该网络连接炎症性TNFα和血管生成性VEGF

金凤燕，通讯作者1 郑香玉，2 杨延平，1 刚瑶，三 龙叶，4 托尔斯滕·杜普纳，5 德克·M·赫尔曼，6 王海峰，通讯作者7和云代通讯作者4
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补充资料

摘要

缺氧诱导因子（HIFs）通过上调各种促血管生成因子（尤其是VEGF）对缺氧的反应来介导血管生成。在这里，我们报道了缺氧意外地诱导内皮细胞（EC）产生大量促炎因子TNFα，这表明存在一个自分泌环，该自分泌环反过来通过NF-κB依赖过程激活HIF，从而产生VEGF，从而促进血管生成。相反，低密度脂蛋白（LDL）阻止缺氧或TNFα暴露的内皮细胞中HIF的表达，而HIF-1α或HIF-2α的敲除显著减弱内皮细胞低氧诱导的VEGF生成以及内皮细胞集落形成和管形成。值得注意的是，低密度脂蛋白通过下调TNF受体TNF-R1而非TNFα本身，以及规范和非规范NF-κB通路的多个关键成分，干扰TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号级联，从而减弱低氧诱导的血管生成。通过这样做，LDL能够抑制或下调HIF依赖性促血管生成下游的广泛靶点和信号。总之，这些发现证明了内皮细胞中存在自我调节的TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号网络，它介导并精细调节血管生成，至少在缺氧时是这样。他们还表明，低密度脂蛋白通过破坏该网络而损害血管生成，这可能代表了低密度脂素抗血管生成特性的一种新机制。

关键词：低密度脂蛋白、低氧诱导因子、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子、核因子-κB、血管生成

介绍

低氧驱动的血管生成是低氧供应的主要适应性反应之一，对维持细胞新陈代谢、生存和功能至关重要，因此代表了胚胎发育、缺血损伤恢复、组织再生、炎症、肿瘤生长等的显著特征[1]. 该事件主要由转录因子低氧诱导因子（HIFs）控制，包括HIF-1α和HIF-2α（最初称为内皮PAS域蛋白-1，EPAS1系统)、HIF-3α和HIF-1β（也称为芳香烃受体核转运体，ARNT公司) [2]. 不同的HIF亚型可能在调节低氧诱导的内皮细胞代谢开关和血管生成中具有不同的功能[2，三]. 众所周知，作为一种主要的转录因子，由一个氧敏感亚单位（HIF-1α或HIF-2α）和一个组成性表达的HIF-1β组成的HIF复合物在各种生理和病理条件下驱动血管生成中发挥着重要作用[4，5]. 在后一种情况下，HIF介导的血管生成（通过VEGF）的重要性已在各种疾病类型中得到充分证明，尤其是与衰老相关的疾病，如动脉粥样硬化（如冠状动脉疾病、缺血性中风）[5]和退行性疾病（如神经退行性变[6]和黄斑变性[7]). 在不同类型的细胞（尤其是内皮细胞）中，HIF的下游基因还参与血管重塑、炎症、细胞存活和增殖、凋亡、自噬、细胞迁移和侵袭、DNA损伤反应、细胞外基质代谢以及葡萄糖代谢（如糖摄取和糖酵解）[8，9].

在HIF家族成员中，HIF-1α在几乎所有哺乳动物组织和细胞类型中普遍表达，因此参与了大多数（如果不是全部）细胞对缺氧的反应，尤其包括通过上调多种血管生成因子（例如VEGF、iNOS、HO1）来启动和促进血管生成在各种类型的细胞中，尤其是内皮细胞[10，11]. 然而，HIF-2α在某些细胞类型（主要是血管内皮细胞）中选择性表达，最近通过诱导内皮特异性基因（如VEGF）的表达，参与血管生成和血管重塑的调节[12]. 尽管有约50%的氨基酸同一性和类似的蛋白质结构，但HIF-1α和HIF-2α似乎在各种生理和病理过程中发挥着不同的、非冗余的生物学作用，包括血管生成，可能是通过激活不同的靶基因[2，三]. 例如，HIF-1α基因敲除导致严重的血管缺陷[13]而HIF-2α缺失导致胚胎发育过程中有缺陷的血管重塑[12]. 虽然一些基因（例如VEGF和其他含有HRE的基因）被HIF-1α和HIF-2α激活，但其他基因优先被一个或另一个激活[14]. 作为缺氧的主要传感器，HIF-1α和HIF-2α具有相似的快速蛋白质转换机制，在决定其蛋白质水平方面起着主导作用，尽管可能取决于不同的氧利用程度和持续时间[2]. 在常氧条件下，HIF-1α和HIF-2α在保守脯氨酸残基（HIF-1β、P402和P564；HIF-2β、P405和P531）处被脯氨酸羟化酶结构域（PHD）羟基化，从而被血管Hippel-Lindau蛋白（pVHL）复合体（一种E3泛素连接酶）识别，通过泛素蛋白酶体系统（UPS）导致其泛素化和降解[15]. 相反，缺氧可阻止这两个HIFα亚单位的氧依赖性羟化，从而与调节亚单位HIF-1β形成活性异二聚体复合物，从而触发具有多种功能的靶基因的转录[15]. 与其伙伴HIF-1α和HIF-2α不同，HIF-1β的表达长期以来被认为是组成稳定的，几乎不受缺氧的影响。除了NF-κB和HIF-1α之间已确立的关系外[16，17]，经典NF-κB通路的激活也被证明在转录水平上调HIF-1β[17，18]. 此外，非规范NF-κB通路的激活（例如通过TNFSF14/LIGHT）也会在转录水平诱导HIF（尤其是HIF-2α）的表达，因为NF-kb B亚单位p52可以直接结合到HIF-2 a启动子上的多个位点[19]. 这些发现表明，这两种主要转录因子之间存在着交替的相互作用，参与了对缺氧的各种适应性反应，包括血管生成。

HIF在内皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞）中的功能已被充分证明，尤其是与动脉粥样硬化中的炎症和血管生成相关[20]. 例如，低剪切应力可能通过NF-κB依赖过程诱导内皮细胞中HIF-1α的表达，这一事件可增强内皮细胞的增殖和炎症激活[21]. 氧化低密度脂蛋白（oxLDL）激活巨噬细胞中的HIF-1α，通过将高脂血症、炎症和血管生成联系在一起传递oxLDL的促血管生成作用[22]. TNFα是主要由免疫细胞（如巨噬细胞）产生的最重要的促炎细胞因子之一，在动脉粥样硬化形成过程中诱导巨噬细胞HIF活化[23]. 在之前的研究中，我们观察到作为NF-κB的经典激活剂，TNFα也可能参与内皮细胞HIF通路的激活[18]. 然而，HIF-1α和/或HIF-2α在调节TNFα诱导的血管生成中的作用尚不清楚，尤其是在缺氧条件下。

众所周知，高胆固醇血症是一个主要的危险因素，由于脂质沉积在血管壁上，因此与动脉粥样硬化有关。另外，包括我们在内的几个小组已经观察到，低密度脂蛋白能够减弱血管生成，特别是在对缺氧的反应中[24–27]. 我们还证明，低密度脂蛋白的抗血管生成活性涉及内皮细胞中HIF-1α和HIF-2α蛋白水平的降低，可能与NF-κB的失活和HIF-1β的下调有关[18]. 然而，TNFα是否以及如何参与内皮细胞缺氧介导的血管生成尚不清楚。在这里，我们首次报道，据我们所知，缺氧诱导内皮细胞产生TNFα，代表一个自分泌环路，进而通过NF-κB依赖过程激活HIF通路，促进内皮细胞产生VEGF和血管生成。因此，这些发现提供了证据，表明内皮细胞中存在自我调节的TNFα/NF-κB/HIF/VEGF单一网络，至少在低氧反应中介导血管生成。他们还认为，低密度脂蛋白可能通过破坏这种信号级联而损害低氧诱导的血管生成。

结果

GEP分析揭示了EC中潜在的以HIF为中心的信号网络

众所周知，HIF通过在缺氧和常压条件下诱导内皮细胞表达促血管生成VEGF及其受体VEGFR1和VEGFR2，在血管生成中发挥重要作用[2，4]. 众所周知，HIF（尤其是HIF-1α）参与巨噬细胞产生促炎性TNFα，进而通过激活NF-κB通路刺激血管生成或血管重塑[10]. 然而，尚不确定内皮细胞中HIF和TNFα之间是否存在任何关系，尤其是因为这两种途径具有促进VEGF生成和血管生成的共同特性。为此，我们首先利用公开可用的基因表达谱数据库（GEP）分析了内皮细胞中的这种潜在关系，以及VEGF和NF-κB通路。所使用的数据集包括一个用于将人类胚胎干细胞（hESC）分化为成熟内皮细胞的数据集（Exp HUVEC vs ESC-James-12-MAS5.0-u133p2）[28]另一个用于比较新鲜分离的静脉内皮细胞（人脐静脉内皮细胞，HUVEC）和动脉内皮细胞（人类脐动脉内皮细胞，HUAEC）（正常内皮细胞HUEC/HUVEC-卢顿-38-MAS5.0-u133p2）[29]. 如所示图1A，热图显示a）之间的基因表达存在许多正相关（红色）HIF1A型和EPAS1系统（HIF-2α；区域#1），和b）HIF1A型或EPAS1系统和TNF公司或其受体（例如。，TNFRSF1B型/肿瘤坏死因子-R2；区域#2）。值得注意的是，尽管HIF1A型和EPAS1系统仅与正相关韩国存托凭证（VEGFR2）在所有VEGF及其受体中，在TNF公司或其受体（两者TNFRSF1A型/TNF-R1和TNFRSF1B公司)和VEGF（例如。，VEGFA（血管内皮生长因子）和VEGFC公司)或其受体(FLT1（飞行高度层1）/VEGFR1，尤其是韩国存托凭证; 区域#3）。它们还与NF-κB途径密切相关（例如。，撕裂1，NFKB2型，RELB公司，IKBKG公司/NEMO、，TNFAIP3/A20；区域#4）。HUVEC和HUAEC进行比较时(图1B)，在2-4区观察到的正相关要少得多，而负相关（蓝色）明显增加。这些结果提出了一种可能性，即胚胎干细胞向内皮细胞的发育可能需要一个包含四种重要血管生成驱动信号通路的网络，包括HIF（尤其是α亚单位）、TNF、VEGF和NF-κB，然而，在内皮细胞成熟后，无论其位于何处（例如静脉或动脉），它都可能在很大程度上被沉默。值得注意的是ARNT公司（HIF-1β）和其他基因在两种环境中均被观察到(图1A和1B)可能反映了其构成稳定的特征。有趣的是，如火山图所示，最显著表达的基因是促炎细胞因子CXCL14型hESC与HUVEC(补充图S1A)，虽然它是韩国存托凭证HUVEC与HUAEC中的（编码VEGFR2，主要VEGF受体）(补充图S1B). 此外，在这两种情况下，即hESC与HUVEC之间，个体基因表达模式也存在显著差异，甚至相反(补充图S2A)以及HUEC与HUVEC(补充图S2B). 总的来说，一旦hESCs分化为成熟EC，参与HIF、TNF、VEGF和NF-κB途径的大多数基因都被关闭，而只有一些基因（例如。，HIF1A型，TNFRSF1A型，地图3K14/与HUVC相比，NIK）可能在HUVEC中保持激活状态（假设在低氧条件下）。

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GEP分析绘制了内皮细胞中HIF、TNFα、VEGF和NF-κB信号通路之间的潜在相关性。(A类，B类)通过使用R2：基因组分析和可视化平台分析EC中涉及基因表达谱（GEP）的数据集，基于对纵向和横向轴上显示的每对基因之间的相关性分析值（红色和蓝色分别表示正相关性和负相关性）(A类; 数据集，Exp HUVEC vs ESC-James-12-MAS5.0-u133p2）人类干细胞（hESC）vs人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）和(B类; 数据集，正常内皮细胞HUAEC/HUVEC-卢顿-38-MAS5.0-u133p2）HUVEC与人脐动脉内皮细胞（HUAEC）。热图中的数字表示每条路径的聚集区域（用虚线勾勒）。(C类，D类)基因本体（GO）分析用于分类(C类)HIF-1α-和(D类)HIF-2α相关基因根据其功能在所有类型的内皮细胞中，包括（数据集，正常内皮细胞HUAEC/HUVEC-卢顿-38-MAS5.0-u133p2）。

为了检测内皮细胞中HIF-1α和HIF-2α相关基因之间的差异，然后进行基因本体（GO）分析，对表达与上述两种基因相关的基因进行分类HIF1A型或欧洲专利局1在不同位置的动静脉内皮细胞中，包括主动脉、冠状动脉、肝动静脉、髂动静脉、肺动静脉、脐动静脉的培养内皮细胞，以及新鲜分离的脐动、静脉内皮细胞（正常内皮细胞HUEC/HUVEC-Luttun-38-MAS5.0-u133p2）[29]. 值得注意的是，最重要的HIF1A型-和EPAS1系统-相关基因分为两个功能不同的基因库。这个HIF1A型-相关基因与EC发育和血管生成更相关(图1C)，而EPAS1系统-然而，相关基因与已知HIF激活所需的线粒体能量代谢相关[30]血管重塑、炎症反应等(图1D). 总之，这些结果支持这样一种观点，即尽管HIF-1α和HIF-2α在促进血管生成方面发挥功能作用，但它们可能通过激活不同的靶基因集发挥作用。

低氧诱导的血管生成与内皮细胞HIF激活和VEGF生成相关

为了确认缺氧诱导因子激活与新生血管生成之间的因果关系，首先进行集落形成实验，以检测缺氧对内皮细胞增殖的影响。如所示图2A，在1%O下培养HUVEC2这种情况导致了菌落数量和大小的急剧增加，相比之下，O2作为对照。此外，HUVEC暴露于1%O2也增强了它们的管状形成能力，反映在细小的血管网中，没有闭合的环（箭头；图2B). 此外，还进行了ELISA检测，以确定内皮细胞分泌的VEGF的量。如所示图2C，暴露于1%O2导致HUVEC以时间依赖的方式增加VEGF的生成。此外，Western blot分析显示暴露于1%O2还导致HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β蛋白水平的时间依赖性增加(图2D（左），当使用乳酸模拟缺氧时，获得了类似的结果（右）。因此，这些结果表明，缺氧通过内皮细胞自分泌VEGF促进血管生成，这是一种与HIF激活相关的事件。

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缺氧诱导内皮细胞的血管生成，与VEGF的产生和HIF的激活有关。(A类，B类)HUVEC在含有2%血清的ECGM培养基中培养，在缺氧（1%O2)或常氧（21%O2)条件，然后对细胞进行以下分析，包括(A类)菌落形成试验（72小时）和(B类)基于基质的试管形成分析（24小时）。显示了至少三个独立实验的代表性显微图像。箭头表示未闭合的血管结构环。(C类)当HUVEC在低氧（1%O2)或常氧（21%O2)条件下，按指定的时间间隔采集培养基，并进行ELISA检测，以确定VEGF的绝对量（pg/ml）。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份*对<0.05和**对与对照组相比<0.01（21%O下72小时2)；ns=不显著。(D类)HUVEC在低氧（1%O）下培养2)条件（左面板）或暴露于化学缺氧模拟乳酸（3 mM）达指定的时间间隔（6-24小时），然后进行Western blot分析以监测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的表达。重制β−肌动蛋白印迹作为负荷控制。

敲除HIF-1α或HIF-2α可阻止缺氧诱导的VEGF生成和血管生成

然后检测HIF-1α和HIF-2α在低氧诱导血管生成中的功能作用。为此，HIF-1α和HIF-2α在HUVEC中被敲除，使用shRNA特异性靶向HIF1A型和EPAS1系统分别是。Western blot分析证实了HIF1A型和环境保护1显著阻止HIF-1α的稳健表达(图3A（左）和HIF-2α（右）在暴露于1%O的HUVEC中2利用这些细胞，进行集落和试管形成实验，以评估HIF-1α和HIF-2α在内皮细胞中的功能作用。事实上，预防HIF1A型或EPAS1系统表达强烈抑制HUVECs在1%氧浓度下的生长2击倒时的状况EPAS1系统甚至比击倒HIF1A型(图3B). 一直以来，尽管击倒其中任何一种都会显著削弱HUVEC在1%氧浓度下形成血管网的能力2状态，表现为管子数量减少和未闭合环增加（箭头；图3C). 在HUVEC中观察到类似的结果，shRNA敲除了ANRT公司(补充图S3A). 最后，击倒HIF1A型或EPAS1系统HUVEC也显著减少VEGF的生成(图3D). 总之，这些发现表明缺氧通过激活HIF通路诱导内皮细胞自分泌VEGF来诱导血管生成。

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敲除HIF-1α或HIF-2α均会损害缺氧诱导的内皮细胞血管生成和VEGF的生成。(A类)用pLKO.1构建物转染HUVEC，该构建物编码靶向HIF-1α和HIF-2α的shRNA，并将干扰序列作为阴性对照（shNC）。由于HUVEC中HIF-1α或HIF-2α的基础水平相对较低，这些转染细胞暴露于1%的O2（21%O224小时后进行Western blot分析，以确认shRNA分别敲除HIF-1α和HIF-2α。(B类，C类)然后将表达HIF-1α或HIF-2αshRNA的HUVEC暴露于1%的O2对于指定的时间间隔，然后进行菌落形成测定(B类，72小时）和基于Matrigel的试管形成分析(C类，24小时）。显示了至少三个独立实验的代表性显微图像。箭头表示未闭合的血管结构环。(D类)同时，在1%O培养72小时后，通过ELISA测定VEGF水平2值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份**对与shNC控制相比，<0.01。

低密度脂蛋白抑制缺氧环境中内皮细胞HIF和NF-κB通路的激活

我们之前已经证明，低密度脂蛋白通过干扰多种促血管生成信号（如SDF/CXCR4）来损害血管生成[31]和VEGF/VEGFR2[27]. 最近，我们发现低密度脂蛋白还通过使NF-κB失活，进而下调HIF-1α和HIF-2α，从而降低HIF-1β的表达，这反过来有助于低密度脂素的抗血管生成作用[18]. 与这些发现相一致，Western blot分析显示，用天然低密度脂蛋白预处理后，HIF-1α、HIF-2α的表达显著降低，HIF-2β的表达和p65的磷酸化程度稍低，反映了NF-κB的失活[32]，在1%O培养的HUVEC中2条件(图4A). 同样，低密度脂蛋白预处理大大减少了用PHD抑制剂DMOG处理的HUVEC中HIF-1α和HIF-2α的积累[33]与p65磷酸化降低相关(图4B). 然而，在暴露于DMOG的HUVEC中，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）不能做到这一点(图4C). 在21%氧浓度下，LDL和oxLDL均不能下调HIF-1β2条件(补充图S3B和3C). 此外，自由基清除剂PBN[34]无法挽救LDL介导的这些事件(图4B)支持一种观点，即低密度脂蛋白可能不需要氧化来抑制HIF和NF-κB通路的激活。尽管DMOG治疗导致细胞核中HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的蛋白水平增加，它们在细胞核中形成活性异二聚体复合物以触发靶基因的转录，但LDL预处理可显著阻断这一事件(图4D和补充图S3D). 同样，与NF-κB抑制剂PDTC预孵育[35]DMOG处理的内皮细胞中HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平也显著降低，但仅轻度影响HIF-1β蛋白水平(图4E). 总之，这些结果表明，低密度脂蛋白（LDL）而非oxLDL能够阻断缺氧诱导的内皮细胞HIF通路激活，并与NF-κB失活相关。

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天然低密度脂蛋白（而非oxLDL）抑制缺氧诱导的HIF和NF-κB信号的激活。HUVEC的处理如下：(A类)用低密度脂蛋白（100μg/ml）预处理48小时，然后在低氧（1%O）下培养2)额外48小时的条件；(B类)在有或无自由基清除剂PBN（2 mM）的情况下，用LDL（100μg/ml）预处理48小时，然后再暴露于PHD抑制剂DMOG（1μM）中72小时；(C类)用指示浓度的氧化低密度脂蛋白（oxLDL，μg/ml）预处理48小时，然后用DMOG（1μM）再处理72小时。治疗后，进行Western blot分析以监测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的表达，以及NF-κB p65的磷酸化（S536）。(D类)或者，按照面板4B所述处理HUVEC，然后分离细胞质和细胞核部分，并进行Western blot分析，以监测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的核移位。将β-肌动蛋白和层粘连蛋白A的印迹分别作为细胞质和细胞核部分的负载对照。(E类)HUVEC与NF-κB抑制剂PDTC（100μM）预先孵育4小时，然后再与DMOG（1μM）孵育72小时，之后通过Western blot分析监测HIF的蛋白水平。

TNFα暴露导致内皮细胞中TNF、HIF、NF-κB和VEGF通路之间的关系出现明显的GEP

众所周知，TNFα激活巨噬细胞中的HIF。然而，TNFα在内皮细胞中的作用尚不明确，尤其是在血管生成方面。为此，GEP暴露于TNFα的EC数据库[36]进行分析，以寻求TNF、HIF、NF-κB和VEGF之间的潜在关系。正如预期的那样，TNFα治疗迅速诱导NF-κB活化，这反映在NFKBIA公司（编码IκBα）和TNFAIP3(补充图S4A)，NF-κB的两个直接下游靶点。如所示图5A，内皮细胞暴露于TNFα导致涉及这些途径的基因表达相关性的不同热图，这与内皮细胞发育的热图明显不同(图1A)或动脉与静脉的内皮细胞(图1B). 值得注意的是，EPAS1系统，而不是HIF1A型，与共同表达ARNT公司（区域#1）。在以下方面也观察到正相关HIF1A型或ARNT公司和韩国存托凭证，以及EPAS1系统和VEGF受体（两者FLT1（飞行高度层1）和韩国存托凭证; 区域#3）。此外，VEGFs的表达（尤其是VEGFC公司)与…相关TNF公司及其受体TNFRSF1A型与NF-κB通路的激活有关（区域#4）。在以下方面也观察到正相关HIF1A型和韩国存托凭证或EPAS1系统和FLT1（飞行高度层1）(补充图S4B)，以及HIF1A型和糖酵解激活剂PFKFB3系列(补充图S4C)已知可以促进血管生成[37]. 相反，HIF1A型或EPAS1系统与NOS3号参与血管生成介质NO的合成[38]和OTUD7B，非规范NF-κB通路的负调控因子[16]. 然而，内皮细胞暴露于VEGF后，这些途径之间的相关性要小得多(补充图S5A)与TNFα治疗相比(图5A). 有趣的是HIF1A型（但两者都不是EPAS1系统也不是ARNT公司)和VEGF受体（两者FLT1（飞行高度层1）和韩国存托凭证)在暴露于VEGF的内皮细胞中观察到(补充图S5B)而所有三个亚单位（尤其是EPAS1系统)TNFα治疗的内皮细胞与VEGF受体呈正相关(图5A). 总之，这些结果表明，TNFα可能通过一个独特的信号网络激活内皮细胞，该信号网络将其自身及其受体与HIFs和NF-κB以及VEGFs，特别是它们的受体连接起来，不同于EC分化、位于动脉与静脉的内皮细胞或被其他促血管生成因子（如VEGF）刺激的内皮细胞。

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缺氧诱导内皮细胞中TNFα自分泌，进而激活HIF和NF-κB产生VEGF。(A类)使用中描述的相同方法图1A和1B，热图是通过分析一个数据集生成的，该数据集涉及TNFα刺激的HUVEC中的基因表达谱（GEP）（数据集，Exp HUVEC TNFα-Kodama-25-MAS5.0-u133p2）。热图中的数字表示每条路径的聚集区域（用虚线勾勒）。(B类)HUVEC在低氧（1%O）下培养2)或常氧（21%O2)条件如所述图2C进行ELISA检测，以确定在指定间隔收获的培养基中TNFα的绝对量（pg/ml）。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份*对<0.05和**对与对照组相比<0.01（21%O下72小时2). (C类，D类)用低密度脂蛋白（100μg/ml）预处理HUVEC 48小时，然后用肿瘤坏死因子α（50 ng/ml）再间隔如下，然后进行Western blot分析以监测NF-κB p65的S536磷酸化（5分钟）和HIFs的表达(C类，4小时）和TNF-R1(D类，4小时）。使用ImageJ软件对TNF-R1的斑点进行密度定量。数值表明归一化为β-肌动蛋白后的折叠变化。(E类)在用IKK抑制剂Bay 11-7082（10μM）预处理4小时后，HUVEC再暴露于TNFα（50 ng/ml）24小时。然后进行实时PCR分析，以确定所示时间间隔内EC中VEGF的表达。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份*对与未处理对照组相比，<0.05；#对与同一时间点单独TNFα相比，<0.05。

低氧诱导内皮细胞产生TNFα，进而激活HIF通路，而LDL通过下调TNF-R1干扰自分泌循环

因为GEP分析表明，在某些情况下（例如。，图1A和5A​5A）中，)因此，我们研究缺氧是否会诱导内皮细胞产生TNFα。事实上，ELISA检测显示缺氧诱导HUVEC以时间依赖的方式显著增加TNFα的生成(图5B). 反过来，TNFα治疗可显著诱导NF-κB活化（例如p65磷酸化）和HIF-1β表达，与HIF-2α的上调相关，HIF-1α的上调程度较低(图5C，车道3对1）。这些结果表明，缺氧条件下内皮细胞中存在TNFα自分泌环。然而，LDL预处理几乎完全消除了基础和TNFα诱导的NF-κB激活以及所有三个HIF亚单位的表达(图5C，车道2对1，车道4对3）。此外，尽管低密度脂蛋白未能减少而非增加内皮细胞的TNFα生成(补充图S5C)，它显著下调TNF-R1，优先解释TNFα诱导的NF-κB活化[39]在TNFα存在或不存在的情况下(图5D). 有趣的是，有人指出，内皮细胞暴露于TNFα也明显降低了TNF-R1，可能反映了通过未知机制对TNFα刺激的负反馈反应。最后，暴露于TNFα诱导HUVEC中VEGF的表达，NF-κB抑制剂Bay 11-7082显著阻断了这一事件[40] (图5E). 总之，这些研究结果表明，缺氧可能通过内皮细胞中TNFα的自分泌环诱导血管生成，这涉及通过激活HIF和NF-κB通路产生VEGF。他们还提出了一种可能性，即低密度脂蛋白通过干扰内皮细胞中的信号网络而损害低氧诱导的血管生成，这主要是由于TNF受体（如TNF-R1）的下调，而非TNFα的下调。

LDL下调经典和非经典NF-κB通路的多种关键成分

由于低密度脂蛋白可能通过下调TNF-R1来破坏TNFα的自分泌循环，于是出现了一个问题，即低密度脂素将如何下调TNF-R2。如上所述TNFRSF1A型（编码TNF-R1）与暴露于TNFα的内皮细胞中NF-κB而非HIF的激活显著相关(图5A). 在此背景下，研究了LDL对涉及规范和非规范NF-κB通路的关键成分表达的影响。与我们之前在暴露于1%O的EC中观察到的情况类似2[18]化学模拟乳酸也可以激活HUVEC中典型的NF-κB通路，这反映在IKKα/β和p65的磷酸化增加[32]，不影响TRAF2蛋白水平(图6A，上部面板）。然而，接触PHD抑制剂（例如DMOG、CoCl2)它通过阻止HIF-1α或HIF-2α的羟基化和蛋白酶体降解而导致其积聚，从而模拟缺氧[2]，未能诱导NF-κB活化（数据未显示）。这些结果表明，为了评估HIF和NF-κB信号通路之间的相互作用，乳酸可能是一种更合适的模拟缺氧的替代方法。而已知TRAF3与NIK结合并导致其泛素化和蛋白酶体降解[32]，我们观察到乳酸也降低了TRAF3但增加了NIK，反映了HUVEC中非规范NF-κB通路的激活(图6A，下部面板）。同样，暴露于TNFα也导致IKKα/β的磷酸化急剧增加(图6B)以及上调的RelB(图6C)与NF-κB2/p52结合以激活非规范NFκB途径[19]. 值得注意的是，LDL预处理下调了涉及这两条NF-κB通路的多个关键成分的基础水平，包括IKKα/IKKβ、p50、p52、p65（RelA）、RelB和c-Rel。LDL预治疗还阻断了TNFα诱导的IKKβ磷酸化和RelB上调，以及下调的IKKα/IKKβ，暴露于TNFα的HUVEC中的RelB和c-Rel，同时逆转了TNFα对IκBα的下调。有趣的是，在TNFα存在的情况下，LDL几乎没有降低p50、p52和p65的蛋白水平(图6B和6C). 综上所述，这些结果表明，除了下调TNF-R1外，低密度脂蛋白还可能通过下调其关键成分使规范和非规范NF-κB通路失活，从而破坏内皮细胞中TNFα的自分泌环。

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LDL通过下调其关键信号成分使TNFα诱导的NF-κB活化失活。(A类)用3 mM乳酸处理HUVEC，如图2D之后进行Western blot分析以评估典型（例如TRAF2表达以及IKKα/β和p65磷酸化）和非典型（例如，TRAF3和NIK的表达）NF-κB通路的激活。(B类，C类)用低密度脂蛋白（100μg/ml）预处理HUVEC 48小时，然后用肿瘤坏死因子α（50 ng/ml）再间隔如下，然后进行Western blot分析以监测IKKα/β的磷酸化（Ser176/180，5分钟）以及规范和非规范NF-κB通路的多个关键成分的表达，包括IKKα、IKKβ、Iκβα（5分钟）、p50（NF-κB1）、p52（NF-kb B2）、p65（RelA）、RelB和c-Rel（4小时）。所有印迹均进行了密度定量，数值表明归一化为β-肌动蛋白后倍数增加。

LDL介导的缺氧诱导血管生成损伤涉及多个HIF依赖性下游靶点

最后，我们试图找出导致低密度脂蛋白抗血管生成活性的HIF的潜在下游事件。为此，研究了低氧暴露的内皮细胞中LDL对已知参与血管生成的主要靶点和途径的影响。如所示图7A低密度脂蛋白（LDL）预处理可显著降低在1%氧浓度下培养的HUVEC中AKT和ERK1/2的磷酸化（激活），以及VEGF受体（如VEGFR1和VEGFR2）和CXCR4的表达2.HUVEC，击倒HIF1A型或EPAS1系统然后用于确定HIF途径的破坏是否会重现LDL的这些效应。确实，HIF-1α或HIF-2α表达的预防(图3A)也显著降低了AKT和ERK1/2的激活，以及低氧诱导的CXCR4表达(图7B，上部面板）。然而，它们未能影响VEGFR1和VEGFR2的蛋白质水平(图7B，下部面板）。总之，这些发现表明，低密度脂蛋白通过TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号网络的失活而损害低氧诱导的血管生成的机制可能涉及内皮细胞中广泛的HIF依赖性下游事件。

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低密度脂蛋白介导的低氧诱导血管生成障碍涉及广泛的HIF依赖信号通路。(A类)HUVEC暴露于指示浓度的LDL（25-100μg/ml）中48小时，然后在低氧（1%O）下培养2)额外48小时的条件(B类)将shRNA敲低HIF-1α或HIF-2α的HUVEC暴露于1%的O2（21%O2作为常氧对照）24小时。治疗后，进行蛋白质印迹分析以监测AKT（S473）、ERK1/2（T202/Y204）、CXCR4、VEGFR1和VEGFR2的磷酸化。重制β-肌动蛋白印迹作为负荷控制。(C类)缺氧通过TNFα自分泌环诱导血管生成并导致内皮细胞自我调节TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号网络激活的机制示意图，以及低密度脂蛋白（LDL）抗血管生成作用的潜在机制，a）LDL可能通过下调其受体TNF-R1而非TNFα本身来损害TNFα的自分泌环；和b）低密度脂蛋白通过下调规范和非规范NF-κb通路的多个关键成分，干扰TNFα-NF-κb-HIF-VEGF信号级联。

讨论

转录因子HIF是各种生理和病理过程中缺氧适应性反应的中枢调节器，包括血管生成和炎症[41]. 在前者中，HIF通过诱导不同类型的细胞（尤其是内皮细胞和巨噬细胞）产生VEGF和其他生长因子，在血管生成过程中充当主开关[42]，以恢复缺氧组织的血液供应和恢复氧合（例如由缺血性疾病引起的，如中风和心肌梗死）[43，44]. 然而，这种保护作用往往因高脂血症而受损，高脂血症在动脉粥样硬化性疾病等与衰老相关的疾病患者中很常见[24–27]. 在后者中，HIF（尤其是HIF-1α）通过促进免疫细胞（尤其是巨噬细胞）产生TNFα和其他细胞因子或趋化因子，在炎症中发挥重要作用[45]. 由于TNFα也是一种有效的促血管生成因子，在某些情况下，HIF-1α介导的巨噬细胞产生TNFα可以被认为是增加血管生成的另一种机制[46]例如在动脉粥样硬化斑块内，巨噬细胞是最丰富的细胞成分[47]. 然而，HIFs和NF-κB（另一个与TNFα和缺氧相关的主要转录因子）在促炎性TNFα与促血管生成VEGFs之间潜在交联中的作用仍有待于在内皮细胞中确定，内皮细胞的活化和功能障碍是年龄相关血管疾病（例如动脉粥样硬化）的标志[48]和新生血管性黄斑变性[49]). 在这里，我们首次表明，缺氧可以诱导内皮细胞自分泌TNFα，而内皮细胞又通过NF-κB依赖性过程激活HIF通路，从而促进内皮细胞产生VEGF和血管生成，这一过程可能不需要巨噬细胞。值得注意的是，低密度脂蛋白的抗血管生成特性可能涉及破坏内皮细胞中以HIF为中心的自我调节信号网络。因此，这些发现可能为研究低氧诱导血管生成的机制及其在高脂血症相关疾病患者中的缺陷提供新的见解。

而免疫细胞（尤其是巨噬细胞）被认为是TNFα的主要来源[45]，很少有研究报道内皮细胞也能分泌TNFα，TNFα形成一个自分泌回路来调节内皮细胞的功能，例如炎症中NO和ICAM的产生[50，51]. 出乎意料的是，我们观察到缺氧暴露能够诱导内皮细胞显著产生TNFα，这与GEP分析显示的内皮细胞中TNFαmRNA的表达以及TNFα或VEGF处理的内皮细胞的上调一致（未显示）。此外，还发现TNF及其受体TNF-R1（由TNFRSF1A型)在TNFα治疗的内皮细胞中，与NF-κB通路的激活呈正相关，而与HIF无关。这些观察结果表明，在缺氧条件下，内皮细胞产生TNF的自分泌环可能依赖于NF-κB的激活，而不是HIF。与缺氧一样，TNFα也激活了NF-κB（包括规范和非规范）和HIF途径。因此，这些事件导致HIF依赖性血管生成因子（如VEGF）的产生显著增加[52，53]和CXCR4[31])与其他促血管生成途径（如ERK1/2和AKT）的激活有关[54]). 结合我们之前的观察，缺氧可通过NF-κB依赖过程诱导所有三个HIF亚单位的上调[18]这些发现有力地证明，缺氧通过内皮细胞中自我调节的TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号网络启动和/或促进血管生成，如图7C.

虽然HIF-1α和HIF-2α在结构和氨基酸组成上具有高度相似性[2]，这两种HIF亚型之间存在许多差异。例如，它们由完全不同的基因编码（即。，HIF1A型和EPAS1系统）[三]. 与HIF-1α在大多数哺乳动物细胞中的普遍表达不同，HIF-2α在某些细胞和组织类型中的表达受到高度限制，尤其是内皮细胞和富含血管的组织[12]. 虽然两者都可以由缺氧诱导，但诱导HIF-2α可能需要比HIF-1α更高程度和更长时间的缺氧[55，56]. 此外，这两种蛋白质的水平主要由PHD催化脯氨酸残基的羟基化（尽管在不同的位置）控制，导致通过von Hippel-Lindau（pVHL）介导的UPS途径快速降解[15]. 然而，最近发现HIF-2α也可能通过另一种过程降解（例如，在常氧条件下，通过与eIF3e/INT6相互作用进行pVHL非依赖性降解）[57]. 由于其内皮细胞选择性表达模式，HIF-2α被认为调节一系列对内皮细胞更为特异的基因，从而发挥不同于HIF-1α的功能作用[58]. 事实上，GEP分析显示，尽管HIF1A型和EPAS1系统，但不是ARNT公司（编码HIF-1β），在EC发育期间以及来自不同位置（例如静脉与动脉）的EC中相关，但其相关基因在EC中属于功能不同的类别。此外，EPAS1系统，但不是HIF1A型，与ARNT公司在暴露于TNFα的内皮细胞中，HIF-2α可能在这种情况下起主导作用。与这一发现一致，我们观察到EPAS1系统在内皮细胞中比HIF1A型抑制低氧诱导的血管生成（例如，细胞增殖、管形成，以及在较小程度上VEGF的生成）。然而，为了解决这个问题，还需要进行进一步的专门研究，以区分HIF-2α和HIF-1α在血管生成（尤其是缺氧诱导的血管生成）中的作用。

包括我们在内的几个研究小组已经证明低密度脂蛋白（LDL）会损害血管生成[24–27]. 在之前的研究中，我们已经证明了LDL抗血管生成特性的潜在机制，LDL通过NF-κB失活在转录水平抑制HIF-1β的表达，从而导致内皮细胞中HIF-1α和HIF-2α的下调[18]. 本研究可能通过提供新的证据支持缺氧条件下内皮细胞中TNFα自分泌循环，进一步深入了解这一机制。我们还发现，在基础未治疗条件下以及TNFα治疗后，用低密度脂蛋白预处理几乎完全关闭HIF和NF-κB通路，导致内皮细胞产生的VEGF显著减少，HIF依赖的广泛下游信号（例如ERK1/2、AKT和CXCR4）失活[31，54]. 然而，尽管LDL也可以下调VEGFR1和VEGFR2的表达，但HIF-1α或HIF-2α的敲低都不能影响它们的蛋白质水平。这些观察结果提出了一种可能性，即其他HIF非依赖性事件（例如VEGF受体下调）也可能有助于LDL的抗血管生成特性。值得注意的是，LDL对TNFα自分泌环的破坏很可能源于主要负责NF-κB活化的TNFα受体TNF-R1的下调[39]而不是由EC阻止TNFα的生成。此外，我们还观察到，低密度脂蛋白通过下调其关键信号成分来阻止TNFα触发的规范和非规范NF-κB通路的激活。总之，低密度脂蛋白抗血管生成特性的潜在机制总结如下图7C.

总之，我们首次观察到缺氧可诱导内皮细胞自分泌TNFα，至少在在体外本研究中使用的血管生成模型。我们还提供证据支持这样一种观点，即缺氧通过激活以HIF为中心的自我调节信号网络促进血管生成，该信号网络涉及EC中四个主要通路之间的相互作用，包括TNFα、NF-κB、HIF和VEGF。最后，我们还对LDL抗血管生成特性的机制提供了新的见解，其中LDL可能通过下调TNF-R1和NF-κB通路的多个关键成分来关闭内皮细胞中的TNFα/NF-κB/HIF/VEGF信号级联，导致广泛的HIF-依赖性下游事件失活。然而，尽管O的百分比很低2（例如，0.5-2%，含21%O2在大气中用作控制）已被广泛应用于绝大多数在体外有关缺氧的研究中，有一个警告，即这些浓度的O2空气中可能不一定反映O的浓度2溶解在介质中或溶解在O2浓度通常在1%到12%之间。因此，这些在体外本研究中的观察结果值得在后续调查中进一步验证体内然而，本研究的结果可能提供了新的证据，支持内皮细胞中血管生成和炎症之间的潜在联系，这两个事件对衰老相关疾病（如动脉粥样硬化）至关重要[59]其中高脂血症是一种常见且主要的危险因素。

材料和方法

细胞培养

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）混合颗粒（1x106RNAlater中的细胞，Cat#C-14011），含有从两个以上供体分离的内皮细胞，从PromoCell（德国海德堡）获得。每个实验都在至少三个不同批次的混合HUVEC中进行。如前所述[54]细胞在含有2%血清、0.1 ng/ml人表皮生长因子（EGF）、1 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、90μg/ml肝素和1μg/ml氢化可的松的内皮细胞生长培养基（ECGM、PromoCell）中培养6代。细胞在湿度为5%的CO中保持在37°C221%O培养箱20.1%O2用于几乎所有缺氧实验的条件都是在一个连续输注含95%N的预先测试气体混合物的腔室中实现的2和5%CO2或者，将乳酸、钴和DMOG（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）用作化学缺氧模拟物。

试剂

LDL和重组人肿瘤坏死因子-α（TNFα）分别购自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）和Peprotech（新泽西州洛基吉尔）。自由基清除剂苯基-N-叔丁基硝基酮（PBN）、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC）、IκB激酶（IKK）抑制剂Bay 11-7082、脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基草酰甘氨酸（DMOG）和乳酸均来自Sigma-Aldrich。本研究中使用的抗体包括小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体（BD Transduction Laboratories，San Jose，CA）；兔抗人HIF-2α多克隆抗体和兔抗总VEGFR1（ab32152）单克隆抗体（Abcam，Cambridge，MA）；小鼠抗人CXCR4（Fusin）单克隆抗体、兔抗人HIF-1β/ARNT多克隆抗体、家兔抗人NF-κB p65单克隆抗体，兔抗总Akt单克隆抗体和兔抗磷酸化Akt（Ser473）多克隆抗体，家兔抗总细胞外信号调节激酶（ERK）1/2单克隆抗体，兔抗磷酸-ERK1/2（Thr202/Tyr204）单克隆抗体，兔抗人TNFR1单克隆抗体，兔抗人IKKα多克隆抗体，兔抗人IKKβ单克隆抗体，兔抗人磷酸IKKα/β单克隆抗体，兔抗人IκBα多克隆抗体，兔抗人p50单克隆抗体，兔抗人p52单克隆抗体、兔抗人p 65单克隆抗体，兔抗人c-Rel单克隆抗体；兔抗人RelB单克隆抗体和兔抗人β-肌动蛋白抗体（Cell Signaling Technology，Danver，MA）；人类VEGF和TNFα量化因子ELISA试剂盒（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。

集落形成分析

将200个HUVECs细胞接种到24孔板中的单个孔中，并在21%或1%的O浓度下生长7天2条件。用PBS洗涤3次后，用甲醇固定细胞并用Giemsa染色。计算菌落数量并拍摄照片。

细胞增殖和迁移分析

2×104HUVEC悬浮在含有0.5%血清的ECGM中，并接种到24孔板中[54]. 培养24小时后，使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；日本熊本Dojindo实验室）分析细胞活力。或者，在改良的Boyden室中进行细胞迁移试验，在24孔板中放置跨孔插入物（直径6.5 mm、孔8.0μm的聚碳酸酯膜插入物；康宁）。2×104将HUVEC接种到上部隔室中并培养24小时。去除表面顶部的非迁移细胞，同时在12个区域对膜底部迁移的细胞进行计数。

基于基质的试管形成分析

2×104HUVEC用ECGM悬浮，然后播种到96 well板的Matrigel涂层孔中[60]. 孵育24小时后，使用DFC-290相机在低倍（5倍）下拍摄照片（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）。对两个分支点之间未闭合的试管进行计数。

低密度脂蛋白氧化

简单地说，用1×PBS透析天然LDL 24小时，然后用10µM CuSO培养4在37°C下透析24小时，然后用含有0.1mM EDTA的1×PBS透析48小时。通过0.22µm过滤器收集氧化低密度脂蛋白，并在一周内使用[18].

质粒与慢病毒转导

大肠杆菌XL1-blue（德国海德堡Stratagene）用于质粒制备，而大肠杆菌Stbl3（Invitrogen）用于制备pLKO.1（Addgene，Cambridge，MA）、pLKO.1-shRNA-HIF1A型，pLKO.1-shRNA-EPAS1系统，pLKO.1-shRNA-ARNT公司（Sigma-Aldrich）。如前所述产生重组慢病毒[61]. 用慢病毒感染HUVEC，然后用流式细胞术进行分类。进行蛋白质印迹分析以证实靶基因的沉默。

蛋白质印迹分析

全细胞裂解物在含有蛋白酶抑制剂的NP40裂解缓冲液中制备（德国罗氏）。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上溶解全细胞裂解物或核/细胞组分，并将其印在聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。然后用5%脱脂牛奶在TBS-T（含0.5%吐温-20的三缓冲盐水，pH 7.2）中封闭膜，然后用一级抗体培养（见“试剂”）。使用增强化学发光（ECL）试剂盒（Pierce，Life Technologies）对斑点进行可视化。用抗β-肌动蛋白（细胞信号技术）重新制备印迹，以确保负载均匀。

定性实时PCR（qPCR）

使用ABI PRISM 7500实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA）进行qPCR分析，以量化靶基因的mRNA水平。简单地说，按照制造商的说明，使用RNeasy Midi试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）提取总RNA。从1µg总RNA合成cDNA。然后通过两步实时PCR分析基因表达：95o（o）C持续30秒，然后进行40个95的循环o（o）C持续5秒，60秒o（o）C持续34秒。以下底漆用于血管内皮生长因子使用：正向，5-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3；向后3-ACGGTAGGTTAGCTCTGGGA-5。参考人类家政基因GAPDH。所有PCR反应均一式三份，基因表达与GAPDH公司使用2-ΔΔCT方法进行计算。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 5进行。值表示至少三个独立实验的平均值±SD，一式三份。使用Student t检验（双侧）或单因素方差分析（ANOVA）和Tukey Post-Hoc检验确定实验变量之间的差异显著性。对<0.05被认为具有统计学意义。

补充材料

补充图1

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补充图2

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补充图3

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补充图4

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补充图5

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致谢

R2：基因组分析和可视化平台(网址：http://r2.amc.nl)用于分析特定条件下内皮细胞的基因表达谱（GEP）。

脚注

利益冲突：所有作者均声明无利益冲突。

资金：这项工作得到了国家自然科学基金会的支持（授予金方81471165号和81670190号，授予戴彦81670189号和81870160号，授予王宏81871555号，授予X郑81873812号）。

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文章来自老龄化（纽约州奥尔巴尼市）由提供Impact Journals有限责任公司