无名指蛋白38通过赋予细胞EMT表型促进非小细胞肺癌进展

患者和标本

研究对象包括208名非小细胞肺癌患者，他们于2005年在复旦大学中山医院胸外科接受了根治性切除术。手术后收集肿瘤和匹配的相邻非肿瘤组织，在-80°C下冷冻，然后用于组织芯片（TMA）构建。2016年至2017年间，分别收集了15个和8个用于qRT-PCR和western blotting分析的配对非小细胞肺癌标本。中山医院研究伦理委员会提供了伦理批准。所有患者均获得知情同意，以收集和保存其样本和详细信息。我们以前的研究中描述了临床病理信息^20,21中位随访期为43个月（范围为1-66个月），于2010年7月完成。总生存率（OS）定义为手术日至死亡日期或手术至最后随访日期之间的时间间隔。

细胞系

人非小细胞肺癌细胞系95C、H460、A549和95D购自中国科学院细胞库（中国上海），正常肺上皮细胞系（16HBE）购自中国上海祥生物公司。95C和95D细胞系在37°C的RPMI 1640培养基（HyClone，美国）中培养，该培养基补充有10%胎牛血清（Gibco，美国）、青霉素（100 IU/ml）和硫酸链霉素（100μg/ml），在含有5%CO的恒温培养箱中培养₂16HBE、H460和A549细胞系保存在Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM，HyClone，USA）中，添加相同的补充剂，并在相同的环境下培养。

肿瘤微阵列与免疫组织化学

关于组织微阵列（TMA）构建的详细信息已在我们之前的报告中提供²²简言之，TMA包括85例鳞癌、110例腺癌和13例其他类型的非小细胞肺癌。在60°C下脱蜡2小时并重新水化后，用3%h封闭石蜡切片₂O（运行）₂灭活内源过氧化物酶活性15min。随后，将切片在100°C的柠檬酸表位检索试剂中培养20分钟，并冷却至室温。为了阻断非特异性结合位点，用5%牛血清白蛋白（BSA）（YESEN，中国上海）处理切片1h，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。主要抗体为兔抗人RNF38（25132-1-AP；1:100稀释；Proteintech）和兔抗人E-cadherin（EP700Y，1:500稀释，Epitomics）。将载玻片与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级抗体（中国上海基因科技公司）在室温下孵育1小时。洗去未与一级抗体结合的残留二级抗体后，用二氨基联苯胺（DAB，Gene Tech，中国上海）对切片进行染色，并在显微镜下观察。

免疫组织化学评价

根据我们之前描述的方法，使用强度（评分范围为0到3，分别表示无、弱、中等和强染色）和阳性肿瘤细胞百分比（1，≤25%；2，25%-50%；3，50%-75%；4，>75%）的组合来评估RNF38的表达⁴综合得分从0分到最高7分不等。≤3的截止值被视为RNF38^低的组，得分较高的被视为RNF38^高的组。这些标准也用于评估E-cadherin的表达。

RNA分离和定量逆转录PCR（qRT-PCR）

使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从组织和培养细胞中提取总RNA。根据制造商的协议，使用PrimeScript RT试剂盒（RRO47A；中国大连塔卡拉）对两微克总RNA进行逆转录。每个qPCR反应在ABI PRISM 7500序列检测系统（美国Applied Biosystems公司）中进行，一式两份，样品一式三份，总反应体积为10μl（SYBR Green Real-Time PCR Master Mix，日本高原）。家政基因GADPH被用作内部标准。采用标准曲线法进行定量。使用GraphPad Prism 5.0软件（GraphPad-software，Inc.，La Jolla，CA，USA）分析相对mRNA表达。引物设计如下：RNF38，正向：5’-AACACGGAGCAGTTCCAC-3’，反向：5’-CCTGGCATACGTCAACA-3’；GADPH，前进：5'-GGTATGACAACGAATTGGC-3'和倒车5-GAGCACAGTACTTTATTG-3'。

蛋白质印迹

在冰上收集组织或细胞，使用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（Beyotime，Shanghai，China）裂解，并在4°C下以12000rpm离心20分钟。将上清液转移到新鲜的试管中，并使用双辛酸（BCA）试剂盒（中国上海，Beyotime）测量蛋白质浓度，用10%SDS-PAGE分离蛋白质样品并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂牛奶封闭1小时后，在4°C下用一级抗体孵育细胞膜过夜。主要抗体为兔抗人RNF38（25132-1-AP；1:1000稀释；Proteintech）、E-cadherin（#1195，1:1000稀释，细胞信号技术）、兔抗人波形蛋白（ab92547，1:1000稀，Abcam）和小鼠抗β-肌动蛋白（AA128，1:1000稀释剂，Beyotime，中国）或小鼠抗GADPH（AG019，1:1000倍稀释，Beyotime，中国）; 后两种抗体被用作内部对照。第二天，将膜清洗三次TBST（Tris缓冲盐水吐温），并在室温下与HRP结合的二级抗体（中国上海贝尤泰）孵育1小时。然后，将膜清洗三次，并使用化学发光HRP底物（Millipore；美国）进行可视化。使用Image-Pro Plus软件6.0版（美国马里兰州罗克维尔Media Cybernetics公司）进行相对蛋白质表达分析。

增殖、菌落形成和伤口愈合分析

根据制造商的方案，使用细胞计数试剂盒-8（CCK8）（中国上海叶森）检测细胞增殖。在集落形成试验中，在12孔板中的每个孔中放置500个细胞，并在10天内观察细胞集落的大小和数量。对于伤口愈合试验，将转染细胞接种到6孔板中，并在37°C下与5%CO孵育₂第二天，在单个微孔中的细胞达到90%的汇合后，用无菌200μl移液管尖端损伤细胞单层。用PBS冲洗分离的细胞，并将细胞与含有10%FBS的DMEM（HyClone，USA）或RPMI 1640（HyClone，USA）培养基一起孵育。在0和48小时时拍摄显微镜照片。进行了三个独立实验。

Transwell分析

使用24孔跨孔板（8-μm孔径，美国纽约州科宁市）评估每个细胞系的侵袭能力。50万个悬浮在无血清培养基中的细胞用Matrigel（BD Transduction，BD转导）置于上腔。然后，将0.6 ml DMEM或RPMI 1640培养基和30%FBS添加到下室。培养48小时后，用棉签擦拭过滤器上的上层细胞。将横孔底部的细胞在甲醇中浸泡20分钟，用0.5%结晶紫染色，并在显微镜下进行计数。

慢病毒的构建和转染

RNF38对照和RNF38-shRNA（短发夹RNA）表达慢病毒由Genomeditech（中国上海）设计和提供。靶shRNA序列的设计如所示补充表1将慢病毒上清转染到含有8μg/ml polybrene（Genomeditech，Shanghai，China）的A549和95D细胞中，建立稳定的细胞系A549-shRNA-RNF38和95D-shRNA-RNF18。对照组分别为A549-shRNA对照组和95D-shRNA对照组。

免疫荧光

将稳定的转染细胞接种到6孔板的盖玻片上。当每个玻璃上的细胞达到20-30%的融合时，用4.0%多聚甲醛固定细胞，用0.2%Triton X-100（中国上海Beyotime）在室温下渗透10分钟，并用PBS洗涤三次。最后，用兔抗人波形蛋白（ab92547，1:100，Abcam）培养细胞或小鼠抗人E-cadherin（ab1416，1:100，Abcam）抗体在4°C过夜。然后，用PBS清洗细胞，并用免疫荧光标记的二级抗体（中国上海Yesen）在室温黑暗中培养2小时，然后进行三次清洗（每次5-10分钟）。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（中国上海叶森）复染10分钟。幻灯片是可视化的，照片是用荧光显微镜拍摄的（日本东京奥林巴斯）。

RNF38在非小细胞肺癌中高表达

采用qRT-PCR、western blotting和免疫组织化学方法研究RNF38在NSCLC中的表达。首先，我们评估了15例非小细胞肺癌患者的mRNA表达水平；如所示图。​图22A类RNF38 mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于正常肺组织（2.82±0.29 vs.1.23±0.13）。此外，与邻近非肿瘤组织相比，8对NSCLC肿瘤中RNF38蛋白的表达明显升高(图。​图22B类; 2.75±0.09对1.24±0.02）。采用免疫组织化学方法，我们检测了RNF38在细胞核和细胞质中的表达。RNF38在非肿瘤组织中的染色强度弱于非小细胞肺癌组织(图。​图22C类). 49%（102/208）的肿瘤组织中检测到RNF38阳性染色(图。​图22D类). 因此，我们的结果表明RNF38在非小细胞肺癌中的表达显著增加。

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图2

非小细胞肺癌患者RNF38表达增加。（A）RNF38 mRNA在15对非小细胞肺癌组织（T）和邻近非肿瘤组织（N）中的表达。（B）RNF38在8对NSCLC组织（T）和邻近非肿瘤组织（N）中的蛋白表达*P<0.05。（C）208对非小细胞肺癌组织中RNF38染色的代表性图片与邻近正常组织相匹配。（D）通过IPP6.0对208对匹配相邻正常组织的非小细胞肺癌组织进行RNF38免疫染色的积分光密度（IOD）值分析*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

RNF38表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性

接下来，我们使用TMA重点研究RNF38的表达和非小细胞肺癌的临床病理特征。我们在之前的研究中描述了详细的临床和病理信息^20,22根据上述RNF38免疫染色强度，我们发现RNF38与年龄、性别或吸烟状态之间没有显著关联。RNF38表达水平与组织学类型（p=0.030）、肿瘤、淋巴结、转移（TNM）分期（p=0.011）、淋巴结转移状态（p=4.43E-05）和肿瘤大小（p=2.09E-04，表​表11). RNF38在鳞癌中的高表达率（60%，51/85）高于腺癌（40.9%，45/110）。TNM分期III-IV（62.5%，40/64）和较大肿瘤（58.3%，81/139）患者中RNF38表达升高的频率高于TNM分期I-II（43%，62/144）和较小肿瘤（30.4%，21/69）患者。此外，与无淋巴结侵犯的组织（43/118；36.4%）相比，有淋巴结转移的组织（65.6%，59/90）RNF38的高表达比例增加。不同子类型的操作系统如所示图。​图3三A类TNM分期较高、体积较大和淋巴结转移的患者表现出更不利的OS。

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图3

RNF38高水平与E-cadherin表达呈负相关，可预测非小细胞肺癌患者预后不良。（A）该非小细胞肺癌患者队列的不同RNF38水平与不同临床病理特征之间的相关性分析，以及对其相应总生存率的估计。（AC：腺癌，SC：鳞状细胞癌，RNF38^高的：RNF38、RNF38高表达^低的：RNF38低表达）。（B）208例非小细胞肺癌患者的代表性照片显示RNF38表达与E-cadherin表达呈负相关。（C）根据RNF38表达状态，208例非小细胞肺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线。（D）根据RNF38和E-cadherin的联合表达，通过Kaplan-Meier生存估计和对数库检验评估预后意义。（第1组，低RNF38和保存的E-cadherin；第2组，RNF38与E-cadherin均高或均低；第3组，高RNF38，受损的E-cadtherin。）

RNF38过表达预测非小细胞肺癌患者的不良预后

本研究人群中5年OS发生率为42.3%。单变量分析显示，大肿瘤（≥3cm）、高TNM分期和淋巴结转移是OS较差的预测因素。其他特征，包括性别和吸烟状况，对OS没有预后影响。我们发现RNF38中的5年操作系统明显较差^高的比RNF38中的组^低的组（53%vs.34.3%; p=0.012；图。​图3三C类). 多变量分析表明，肿瘤大小（p=0.002）、TNM分期（p=0.046）和淋巴结转移（p=0.002）是OS的独立预测因素（p=0.944；表​表22).

RNF38和E-钙粘蛋白表达之间的关系是基于上述TMA评估的得分来评估的。在RNF38和E-钙粘蛋白表达之间观察到显著的负相关（p＝0.025；补充表2). 相关分析显示，非小细胞肺癌与RNF38^高的表达倾向于表达低水平的E-cadherin，反之亦然。典型的免疫组织化学染色如图。​图22B类为了评估RNF38和E-cadherin对非小细胞肺癌患者预后的联合影响，将患者分为三个亚组。第1组RNF38较低且E-钙粘蛋白表达保持不变（n=52），第2组RNF39和E-钙黏蛋白水平较高或较低（n=88），第3组RNF36较高且E-钙黏蛋白表达受损（n=68）。有趣的是，我们发现第1、2和3组的5年OS率分别为65.4%、36.4%和33.8%。3组之间存在显著差异（第1组vs.第2组，p=0.002；第1组vs.第3组，p=1.54E-04，图。​图44D类). 第2组和第3组的OS显著低于第1组的OS。

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图4

RNF38促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭。（A、B）。通过实时qRT-PCR和western blot分别确认NSCLC细胞株中RNF38 mRNA和蛋白水平。β‑actin作为负荷对照。（C）RNA干扰显著降低了A549和95D细胞中RNF38的表达。（D）采用伤口愈合试验评估A549和95D细胞的迁移能力。（E）使用Transwell分析法测量shRNF38转染的A549和95D细胞侵袭能力的变化。（F）为了测量细胞生长，使用CCK‑8检测在不同时间间隔（12至72小时）下调RNF38后NSCLC细胞的变化。（G）用sh-对照或sh-RNF38处理的非小细胞肺癌细胞集落形成活性的变化。使用Student t检验计算P值。所有条形图均描述了三次结果的量化，平均值为±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

RNF38水平升高参与非小细胞肺癌细胞的迁移、增殖和侵袭

在本研究中，RNF38与淋巴结转移（p=4.43E-05）和肿瘤大（p=2.09E-04）有显著关系，这促使我们研究RNF38的潜在生物学功能。在四种非小细胞肺癌细胞系中（图。​（图44A类和4B类)A549和95D在mRNA和蛋白质水平上都具有最高的RNF38表达。我们使用RNF38-shRNA慢病毒及其对照沉默了A549和95D细胞中RNF38的表达。Western blotting用于检测RNF38的敲除效率(图。​图44C类). 与对照组相比，RNF38诱导的非小细胞肺癌细胞在划痕试验中的细胞运动受到显著抑制(图。​图44D类). 在transwell-Matrigel侵袭试验中一致检测到95D-shRNF38和A549-shRNF38细胞的侵袭能力受损(图。​图44E类). RNF38增强的非小细胞肺癌细胞的集落形成明显减少(图。​图44G公司). 细胞增殖用CCK8试剂盒和微孔板阅读器测量，OD值为450 nm。RNF38干扰的细胞增殖能力降低(图。​图44F类). 总的来说，RNF38促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。

这项工作得到了国家自然科学基金会（No.81560401）的支持。