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心理药理学杂志。2017年12月；31(12): 1519–1526.
2017年6月28日在线发布。 数字对象标识：10.1177/0269881117715597
PMCID公司：项目编号5714154
PMID：28655286

与精神分裂症相关的II组代谢型谷氨酸受体3（mGlu3，GRM3）亚型与典型的mGlu2相互作用并减少配体结合

Aintzane García-Bea公司，1 伊莎贝尔·贝穆德斯，2 保罗·J·哈里森，1,三和特蕾西A巷1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

II组代谢型谷氨酸受体3（GRM3，mGlu3）基因除了以全长转录物的形式表达外，还以mRNA亚型的形式表达，该亚型缺少外显子4（GRM3-Δ4），并被预测为编码具有新C末端的蛋白质（称为mGlu3-Δ4。这种变异可能有助于GRM3作为精神分裂症风险基因的作用机制。然而，人们对mGlu3Δ4的性质或功能知之甚少。在这里，使用瞬时转染的HEK293T/17细胞，我们证实GRM3Δ4 cDNA被翻译，mGlu3Δ4作为同源二聚体和单体存在，并主要定位于包括质膜在内的细胞膜。共免疫沉淀显示mGlu3Δ4与标准mGlu3。mGlu3Δ4不结合mGlu2/3拮抗剂[三【H】LY341495年，但mGlu3Δ4的存在降低了[三【H】LY341495年与mGlu3相比，膜相关mGlu3。这些实验表明，mGlu3Δ4可能对mGlu2产生负调节，从而影响GRM3/mGlu3在精神分裂症中的作用以及作为治疗靶点的作用。

关键词：代谢型谷氨酸受体，选择性剪接，G蛋白偶联受体，亚型，精神分裂症

介绍

II组代谢型谷氨酸受体3（mGlu3）是一个7跨膜结构域，G蛋白偶联受体（GPCR），由染色体7q21.1-2上的GRM3基因编码。它与腺苷酸环化酶负耦合，部分作为抑制性自身受体，影响突触可塑性和大脑功能的许多其他方面(Niswender和Conn，2010年). 在许多神经精神疾病的病理生理学和治疗中，包括情绪和焦虑障碍（例如。Kandaswamy等人 2013年;Kim等人 2014年;斯旺森等人 al.，2005年). 然而，mGlu3与精神分裂症的关系最为密切(Harrison等人 等人，2008年;莫雷诺等人 2009年). mGlu2/3激动剂可以逆转由NMDA受体拮抗引起的行为和认知缺陷，这是一种广泛使用的疾病模型，在啮齿动物和人类中都有发现，这一发现初步表明了这一参与(Krystal等人 al.，2005年;Moghaddam和Adams，1998年). 这些发现得到候选基因研究的补充，该研究显示GRM3单核苷酸多态性（SNPs）与精神分裂症和相关内表型的关联(Egan等人 al.，2004年;Tan等人 2007年). 当GRM3基因座被发现对精神分裂症具有全基因组意义时，证据变得更加引人注目(精神基因组学联合会精神分裂症工作组，2014年). 因此，尽管有希望的临床试验证据表明，mGlu2/3激动剂是一种有效的抗精神病策略(Patil等人 2007年)尚未确认(基诺等人 2015年)GRM3/mGlu3对精神分裂症及其治疗的作用机制仍有相当大的兴趣。

GRM3基因座与精神分裂症的遗传关联是基因内的，来自外显子3周围的区域(Egan等人 al.，2004年;哈里森等人 等人，2008年;精神基因组学联合会精神分裂症工作组，2014年). 在没有证据表明连锁不平衡中编码变异的情况下，遗传关联的机制可能涉及基因的调控和表达，可能是通过对选择性剪接的影响(肖特（Xiao et） 2017年). 支持这一论点，萨托利斯等人 al.（2006）鉴定出一种mRNA亚型，该亚型缺少外显子4（GRM3Δ4），并预测其编码一个带有新的96氨基酸C末端的截短蛋白（mGlu3Δ4；图1). 这些作者后来报道称，GRM3精神分裂症风险基因型受试者脑组织中GRM3Δ4 mRNA的相对丰度增加(萨托利斯等人 等人，2008年). 因此，该亚型可能有助于GRM3/mGlu3在该疾病中发挥作用。萨托利斯等人 al.（2006）显示GRM3Δ4被翻译并定位于细胞膜，在神经元中定位于神经突起。然而，对于mGlu3Δ4是否具有功能，无论是其本身还是通过与全长mGlu3.相互作用，我们都一无所知。其他GPCR提供了这两种可能性的先例，尤其是后者(Niswender和Conn，2010年;怀斯，2012年). 例如，剪接变异体可以通过多种机制影响其典型受体的活性，包括改变细胞内运输、异二聚体化和对配体结合的影响。本研究的目的是使用一系列方法和测定方法，在用GRM3和/或GRM3Δ4瞬时转染的HEK293T/17细胞中研究这些过程。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为10.1177_0269881117715597-fig1.jpg

mGlu3Δ4示意图及其与规范mGlu3.的关系。（a） GRM3轨迹示意图。全长受体来自一个六外显子转录本（GRM3），七个跨膜结构域区域由外显子IV编码。起始密码子位于外显子II，终止密码子位于第VI外显子。GRM3Δ4是一个缺少外显子4的转录本，导致移码导致新的C末端。（b） 全长mGlu3，显示大的细胞外N末端区域（蓝色）、跨膜结构域（红色，带黑色矩形）和细胞内C末端（黑色）。配体结合域位于细胞外区域，由25-508个氨基酸组成。mGlu3Δ4具有相同的N末端441氨基酸，但缺少细胞外结构域和跨膜结构域的其余部分，并且具有较短的新C末端（绿色）。新的C末端的氨基酸序列在Sartorius等人（2006年）.

材料和方法

构件

将具有C末端V5标签的GRM3、GRM3Δ4和GRM3Δ4的开放阅读框（GRM3Δ4-V5）克隆到pCI-neo表达载体（Promega E1841）中，使用生态1和XbaI公司限制站点。该载体使用人类巨细胞病毒启动子来驱动哺乳动物细胞中的组成性表达。在用于转染人类胚胎肾（HEK293T/17）细胞之前，通过定点突变（Stratagene 200523）对构建物进行测序和校正。选择该细胞系是因为它不表达内源性mGlu3，并通过逆转录聚合酶链反应证实（数据未显示）。

细胞培养和瞬时转染

HEK293T/17细胞（ATCC CRL-11268）保存在Dulbbeco改良的Eagle's培养基（DMEM；Sigma D6546）中，补充10%胎牛血清（FBS）（Sigma F9665）和4 mM l-谷氨酰胺（SigmaG7513）。细胞生长在3.8厘米2免疫细胞化学用玻璃盖玻片，western blot和放射配体结合分析用烧瓶，种子密度为5×104细胞/厘米2.

为了进行转染，将细胞接种、培养24小时，然后使用标准脂质方案进行转染。简单地说，每个构造（浓度为533.33 ng/μL，相当于200 ng/cm2)与20%葡萄糖以3:1 DNA与葡萄糖的比例混合。将浓度为5.6 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI；Sigma-Aldrich 408727）以1:3.3（PEI与DNA葡萄糖）的比例添加到混合物中。将混合物在室温下培养5分钟，然后添加到转染培养基（DMEM 4.5 g/L葡萄糖、10%FBS和2 mM谷氨酰胺）。细胞在转染混合物中培养24小时，然后交换培养基，并在收获前再培养24小时。

膜和细胞溶质部分制备

根据制造商的说明，使用试剂盒（美国加利福尼亚州米利皮塔斯市Biovision Incorporated）提取浓缩用于膜的细胞组分，并进行了微小修改。用细胞刮板收集细胞，并用均质器在均质缓冲液中溶解细胞。对于western blot实验，100µM碘乙酰胺和蛋白酶抑制剂（cOmpleteTM（TM），罗氏）添加到此缓冲液中。在1000×克在4°C下保持10分钟。收集所得上清液并以10000×克在4°C下放置30分钟，使膜部分颗粒化，最终上清液成为细胞溶质部分。对于western blot分析，将颗粒重新悬浮在RIPA缓冲液中（添加蛋白酶抑制剂），对于放射配体结合实验，将其重新悬浮在磷酸盐缓冲液（10 mM K2高性能操作4，1 mM千赫2人事军官4和100 mM KBr；pH值7.6）。按照标准方案，使用Bradford试验（Sigma B6916）测定总蛋白浓度。

蛋白质印迹

如前所述进行蛋白质印迹实验(加西亚-比亚特 2016年). 简单地说，将1µg总膜蛋白在4–20%的小蛋白聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad 4561095）上，在100V的SDS/Tris/甘氨酸缓冲液（25 mM Tris-HCl，250 mM甘氨酸，0.1%SDS）中运行2 h。将蛋白质转移到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上（25 V过夜）用5%脱脂奶在PBST（含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲液）中封闭40分钟。在室温下，用2%脱脂牛奶在PBST中进行一级和二级抗体孵育，分别孵育1小时和40分钟。按照制造商的说明添加了增强型化学发光试剂（英国拉夫堡费希尔科学公司GE Healthcare）。然后将这些斑点暴露在胶片上（GE Healthcare），并使用AlphaImager3400系统进行数字捕获。所用抗体的详细信息见表1.

表1。

所用抗体和浓度的详细信息。

抗体供应商产品代码批次表位使用的浓度
工作分解结构国际商会免疫共沉淀
微胶3阿布卡姆约166608YJ100911CS型845-C总站1:100,0001:5000–
微胶3阿布卡姆约188750GR230043-1、GR230043-2N端域1:1000
V5 HRP共轭Invitrogen公司46-0708861217版本51:10,000––
第5版FITCInvitrogen公司46-03081819586版本51:1000
mGlu2/3型Millipore公司AB1553型1652168戊二醛C末端（NGREVVDSTTSSL）––1:50
N-钙粘蛋白BD生物科学61092078545–1:10,000––
GAPDH公司阿布卡姆约9484GR165366-3型–1:5000––
α微管蛋白阿布卡姆约7291GR200985-3型aa 426–450型–1:2000–
HRP山羊抗兔比奥拉德172-1019350003011–1:10,000––
HRP山羊抗小鼠比奥拉德172-1011350003068–1:5000––
Alexa 568山羊抗兔Invitrogen公司A11011型623962––1:1000–
Alexa 488山羊抗小鼠Invitrogen公司A11001型632115––1:1000–
Alexa 488驴抗鼠Invitrogen公司2003年1月1696197––1:1000–

Co-IP：免疫共沉淀；FITC：异硫氰酸荧光素；HRP：辣根过氧化物酶；免疫细胞化学；WB：western blot；aa：氨基酸。

免疫细胞化学

HEK293T/17细胞生长在涂有50µg/mL聚赖氨酸（Sigma）的玻璃盖玻片上，并如上所述进行转染。细胞在多聚甲醛（4%w/v磷酸盐缓冲液（PBS）中室温下固定15分钟，在PBS中洗涤3次5分钟。细胞在含有0.1%Triton-100X和10%山羊血清的PBS中室温下封闭并渗透40分钟。一级抗体(表1)在封闭溶液中稀释，并在室温下与细胞孵育1h。盖玻片在PBS中清洗三次，持续15分钟，并与二级抗体孵育(表1)在室温下清洗40分钟，并在PBS中清洗三次15分钟，最后用蒸馏水冲洗。将盖玻片风干，用DAPI（Vector，H-1200）安装在Vectashide防褪色安装介质中，并在4°C下储存。

协同免疫沉淀

如前所述，进行了共免疫沉淀研究(González-Maeso等人 等人，2008年)稍作修改。简单地说，将1 mg总膜蛋白在4°C下与等量的RIPA缓冲液（R0278，Sigma）（含有1%SDS和2%Triton X-100）一起旋转培养1 h。在4°C下以17000 x g离心15分钟后，将上清液与蛋白A/g珠（sc-2003，Santa Cruz）孵育1小时，然后以14000转/分钟离心1分钟。将400微升上清液与40µL蛋白A/g珠和1:50稀释的mGlu2/3抗体孵育过夜(表1)旋转轮上的温度为4°C。样品在4°C、17000 x g的温度下离心1分钟，用含有蛋白酶抑制剂（cOmplete）的RIPA缓冲液洗涤沉淀珠三次TM（TM），罗氏），并重新悬浮在含有0.5%SDS和1%Triton X-100的RIPA缓冲液中。用2×Laemmli缓冲液稀释珠子，煮沸5分钟，17000×g离心1分钟，4°C，用于western blot分析的上清液，并使用V5标签抗体进行探测(表1).

放射性配体结合

[三【H】LY341495年结合试验（ART1439 250，美国放射性标记化学品）如前所述进行，但进行了微小修改(González-Maeso等人 等人，2008年). 简言之，将3µg总膜蛋白在4°C下孵育，并增加[三【H】LY341495年磷酸盐缓冲液（10mM K）中（0–30 nM）2高性能操作4，1 mM千赫2人事军官4和100 mM KBr；pH 7.6，也称为培养缓冲液）。90分钟后，通过用培养缓冲液预润湿的GF/C玻璃纤维过滤器（Whatman，1822-849）在真空下快速过滤，将游离放射性配体与结合的放射性配体分离。然后用冷培养缓冲液清洗过滤器三次，并使用Ecoscint H闪烁溶液（国家诊断）和三碳分析仪（PerkinElmer）通过液体闪烁光谱法（5分钟）对放射性进行计数，三碳分析仪的计数效率为65%[三H] ●●●●。在1 mM l-谷氨酸存在下测定非特异性结合。每项实验中，所有样品均一式两份。每个条件下的实验至少重复三次。

统计分析

由未配对的Student’st吨-测试。饱和结合分析中的表观平衡解离常数（Kd）和特定结合位点的最大密度（Bmax）的值通过非线性分析确定。通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验对各组之间的Bmax和Kd进行比较。所有统计分析均使用GraphPad Prism v.6.0进行。重要性级别设置为第页<0.05，双尾。

结果

mGlu3Δ4以单体和二聚体形式存在，主要定位于细胞膜

在转染GRM3Δ4的HEK-293T/17细胞中，用N端抗mGlu3抗体进行western blotting，在~75kDa和~150kDa处显示条带，分别对应于单体和同二聚体mGlu2Δ4预测的分子量(图2，车道1和2）。信号集中在膜部分(图2，通道1），免疫反应性弱得多，仅在细胞溶质部分可清楚检测到二聚体(图2，车道2）。转染GRM3Δ4-V5（数据未显示）后，以及使用之前报道的定制抗mGlu3Δ4抗体时，mGlu2Δ4的带型和主要膜定位相同(加西亚-比亚特 2016年; 数据未显示）。胞浆蛋白GAPDH(图2和膜蛋白N-钙粘蛋白(图2，泳道5和6）用于评估每个级分的纯度。

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免疫印迹显示mGlu3Δ4在膜部分富集，并以二聚体和单体的形式存在。通道1:mGlu3Δ4，膜分数。通道2:mGlu3Δ4，细胞溶质分数。通道3:GAPDH，膜分数。通道4：GAPDH，细胞溶质部分。通道5：N-钙粘蛋白，膜分数。通道6：N-钙粘蛋白，细胞溶质部分。泳道1、3和5以及泳道2、4和6来自同一样本。

进行免疫荧光以提供关于mGlu3Δ4细胞定位的进一步信息(图3). 首先，我们确认在转染GRM3后，典型的mGlu3在质膜和其他膜上显示出预期的定位(图3（a）)，与α-管蛋白联合免疫染色以描绘细胞形态证实(图3（b）和（c）). GRM3Δ4-V5的单独转染显示mGlu3Δ4的分布类似(图3（d）到（f）)信号集中在包括质膜在内的膜上。GRM3和GRM3Δ4-V5的共转染似乎没有改变mGlu3免疫反应性的分布(图3（g）到（i）。当非标记的GRM3Δ4被单次转染并使用N末端抗mGlu3抗体检测时，mGlu2Δ4的细胞内分布相同，表明V5标记不影响贩运（数据未显示）。

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免疫荧光显示mGlu3和mGlu3-Δ4的主要膜定位。（a） –（c）转染GRM3，显示mGlu3（a）、微管蛋白（b）和合并图像（c）的免疫反应性。（d） –（f）转染GRM3Δ4-V5，显示mGlu3Δ4（d）、微管蛋白（e）和融合图像（f）的免疫反应性。（g） –（i）共转染GRM3和GRM3Δ4-V5，显示mGlu3（g）、微管蛋白（h）和融合图像（i）的免疫反应性。DAPI染色（蓝色）如（c）、（f）和（i）所示。棒材：10µm（注意（d）–（f）中的不同放大倍数）。

共免疫沉淀显示mGlu3Δ4与mGlu2相互作用

为了观察mGlu3Δ4和mGlu2是否相互作用，我们使用了与mGlu2/3抗体共同免疫沉淀法(表1)并用V5标签抗体进行免疫印迹。正如预期的那样，当细胞分别转染GRM3Δ4-V5和GRM3，然后混合在一起时，未发现条带(图4而与GRM3Δ4-V5和GRM3共同转染的细胞产生的mGlu3Δ4条带的预测大小(图4，通道2），表明mGlu3确实与mGlu2Δ4发生物理相互作用。

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共免疫沉淀显示mGlu3和mGlu3-Δ4的相互作用。通道1：将转染GRM3或GRM3Δ4-V5的细胞混合在一起，然后用mGlu2/3抗体进行免疫沉淀，并用V5标签抗体进行探测。通道2：细胞共同转染GRM3和GRM3Δ4-V5，然后用mGlu2/3抗体进行免疫沉淀，并用V5标签抗体进行探测。

mGlu3Δ4减小[三【H】LY341495年与mGlu3的结合与mGlu的膜丰度

作为受体功能的初步测量，我们检测了选择性mGlu2/3拮抗剂的结合[三【H】LY341495年(约翰逊等人 1999年;金斯顿等人 1998年). 我们在用GRM3Δ4转染的细胞中没有发现特异性结合（数据未显示），而放射性配体与GRM3转染的细胞结合，估计Bmax为18150±317fmol/mg蛋白质，Kd为0.43±0.04nM(图5（a）). GRM3Δ4与GRM3的共转染显著降低了Bmax(图5（a）和（b）)但并未改变Kd（0.34±0.06与0.43±0.04 nM）。用空载体联合转染GRM3对Bmax无影响(图5（a）和（b）).

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mGlu3Δ4对[三【H】LY341495年mGlu3的结合和丰度。（a） 饱和度曲线显示[三【H】LY341495年在单独转染全长GRM3（圆形）后，转染GRM3和空载体（方形），并共同转染GRM2和GRM3Δ4（三角形）。（b）[三【H】LY341495年全长GRM3（FL）、共同转染的GRM3和GRM3Δ4（FL:Δ4）以及带有空载体的全长GRM3（FL:空载体）的Bmax***第页<0.001. （c） 用mGlu3 c末端抗体检测膜蛋白的Western blot(表1). 通道1：全长GRM3单独转染。通道2：GRM3和GRM3Δ4的联合转染。注意，与1相比，2的免疫反应性较低。车道3和4是车道1和车道2的较长曝光，以提高~95kDa单体带的可视性。（d） ：GRM3和GRM3Δ4共转染后的western blots相对定量显示，与单独转染GRM3后的免疫反应相比，mGlu3二聚体和单体的免疫反应性降低***第页<0.001.

prot：蛋白质

然后，我们使用放射配体结合实验中的蛋白质提取物进行western blots，发现与单独转染GRM3和GRM3Δ4的细胞相比，联合转染GRM2和GRM2Δ3的细胞膜中mGlu3免疫反应性降低(图5（c）和（d）)，表明在mGlu3Δ4存在的情况下，与mGlu3的结合减少反映了mGlu3丰度的降低。共转染后膜mGlu3免疫反应性降低，但胞质mGlu2免疫反应性没有任何代偿性增加（数据未显示）。

讨论

先前已鉴定出编码mGlu3的C末端变体亚型GRM3Δ4的转录本(萨托利斯等人 2006年)其表达受精神分裂症相关GRM3风险SNP的影响(萨托利斯等人 等人，2008年). 在这里，我们使用HEK293T/17细胞显示，该转录物被翻译，产生的mGlu3Δ4蛋白浓缩在膜中，包括质膜(图2和​和3），三)，确认了早期的观察结果(加西亚-比亚特 2016年;萨托利斯等人 2006年). 我们进一步证明mGlu3Δ4与mGlu3共免疫沉淀(图4)它的存在降低了典型mGlu3的丰度和mGlu2/3拮抗剂的Bmax[三【H】LY341495年(图5). 因此，mGlu3Δ4似乎是mGlu2的负调节剂，因此GRM3Δ4亚型可能有助于GRM3等位基因变异与精神分裂症风险相关的机制。该发现还与mGlu3配体作为一系列疾病的潜在治疗剂的研究相关。

GPCR被认为即使不完全作为二聚体而不是单体发挥作用，也在很大程度上发挥作用(Gurevich和Gurevich，2008年). 正如预期的那样，我们检测到全长mGlu3主要是二聚体（根据分子量判断）(图5（c）; 另请参见加西亚-比亚特 2016年). 有趣的是，mGlu3Δ4也被部分检测为二聚体(图2尽管缺乏被认为对GPCR二聚化至关重要的跨膜结构域(布伦格等人 al.，2005年). 推测保守的N末端区域或新的C末端就足够了。我们的联合免疫沉淀数据令人信服地表明，mGlu3和mGlu3-Δ4在物理上相互作用，暗示但不能证明异二聚体的发生(Scarselli等人 2016年). 鉴于异二聚体的潜在生理和治疗意义，这需要进一步研究(Farran，2017年;米利根，2009年;Rozenfeld和Devi，2010年).

最初被认为是罕见的，现在很清楚，大多数GPCR，包括mGlu受体，除了典型（野生型）受体外，还表达为剪接变异体(爱因斯坦等人 等人，2008年;Niswender和Conn，2010年). 其中许多亚型，如mGlu3Δ4，被截断（尽管程度不那么极端），失去一个或多个跨膜结构域，并有一个新的C末端(怀斯，2012年). 许多GPCR变体的意义尚不清楚；甚至它们在蛋白质而非mRNA水平上的存在也一直没有得到证实。然而，也有一些值得注意的例子。多巴胺D3受体以截短变异体D3nf的形式存在，全长D3受体与之相互作用，D3nf的存在阻止D3受体定位于质膜(卡帕等人 2000年). 事实上，许多截短的变体被认为促进了典型受体在内质网中的保留，从而以显性负向作用(布伦格等人 al.，2005年;怀斯，2012年). 我们的数据表明，mGlu3Δ4也可能部分以这种方式发挥作用，因为尽管使用免疫荧光法观察到mGlu3-Δ4存在时，mGlu 3的膜定位没有发生质的变化(图3)，使用半定量western blots评估膜结合的mGlu3免疫反应性降低(图5（c）和（d）). 很容易将后一个观察结果与GRM3Δ4共转染导致减少的发现联系起来[三【H】LY341495年与mGlu3结合(图5（b）). 也就是说，Bmax较低，因为可用于结合的mGlu3受体较少；然而，这仍有待直接证明。类似地，这些效应是否直接由共免疫沉淀数据所表明的蛋白质之间的物理相互作用引起，有待研究。一种可能是mGlu3Δ4改变了mGlu2的处理，可能促进溶酶体降解，而不是膜插入或再循环；其他GPCR的C末端变异也有这种影响(Heydorn等人 al.，2004年;Trejo和Coughlin，1999年). 然而，使用“blastp”搜索UniProt数据库并没有发现mGlu3Δ4 C末端氨基酸序列中的任何同源性或基序，这可能有助于阐明这种或其他推测的机制；这项研究仅仅表明，在其他几种哺乳动物中也发现了类似的mGlu3变体。

另一个与GPCR剪接变异体有关的问题是，它们在结合同源配体和启动下游信号传递的意义上是否具有自身的功能。许多似乎没有活性，但已经确定了几个这样的例子，包括mu阿片受体MOR-1、生长抑素sst5受体和趋化因子受体CCR5和CXR4(怀斯，2012年). 已知mGlu1的几个活性C末端剪接变体，它们保留不同程度的激动剂效力和第二信使反应(赫尔曼斯和查利斯，2001年). 然而，我们没有发现任何证据表明mGlu3Δ4可以结合[三【H】LY341495年。这可能是因为N端绑定域被截断(图1（b）)mGlu3Δ4也缺失了跨膜结构域附近的关键半胱氨酸残基，该结构域稳定配体结合所需的构象(Huang等人 2011年;Muto等人 2007年;Vafabakhsh等人 2016年). 考虑到去磷酸化被认为会影响受体的信号传导和运输，mGlu3Δ4的C末端缺乏一个20个氨基酸的区域，该区域在mGlu3内充当蛋白磷酸酶PP2C结合结构域，这也可能是相关的(弗拉乔莱特 al.，2003年).

总之，我们发现mGlu3Δ4是与精神分裂症遗传风险相关的mGlu三的一种亚型，它影响典型mGlu3:mGlu3-Δ4的功能，降低了mGlu_3结合配体的可用性，可能减少通过受体的信号传递。这种效应具有治疗相关性，因为它可能会改变mGlu3激动剂、拮抗剂和变构调节剂的作用。然而，还需要进一步的工作来扩展调查结果并澄清这些解释。首先，为了证实我们的数据，我们使用了更多生理水平的mGlu3和mGlu3-Δ4表达，并使用了神经元或胶质细胞系，或来源于干细胞的这些谱系的细胞，尽管在这些细胞中，受体的内源性表达会使实验变得复杂。其次，阐明mGlu3和mGlu3-Δ4相互作用的分子基础，以及mGlu3-mediated signaling和mGlu 3与其他蛋白质相互作用的下游后果(Magalhaes等人 2012年). 第三，人类大脑中内源性mGlu3Δ4的存在尚不确定。Sartorius等人 al.（2006）在额叶皮层匀浆中报告了一条预测大小的亚型带，但加西亚-比亚特 al.（2016）这两项研究之间的差异可能与他们使用不同的抗体并研究不同的大脑区域有关。最后，包括选择性剪接的基因表达越来越被认为是精神分裂症遗传关联的重要因素(弗罗默等人 2016年;哈里森和温伯格，2005年;Kleinman等人 2011年;法律et 2006年;Li等人 al.，2016年a;高田等 2017年;Tao等人 2014年)和其他疾病(Li等人 al.，2016年b;Parikshak等人 2016年). 大多数研究此主题的实证研究都集中在mRNA上，因为可以使用敏感和特定的方法来识别和量化转录物。然而，如图所示，为了充分理解基因组研究结果的病理生理学和治疗意义，还必须确定编码蛋白亚型的下游影响(科利尔等人 2016年;哈里森，2015;舒伯特等人 2015年).

致谢

我们感谢来自Micron Oxford Advanced Bioimaging Unit（由Wellcome Trust Strategic Award no.091911资助）的Andrew Jefferson提供共焦成像协助。我们感谢尼古拉斯·巴恩斯（Nicholas Barnes）、格兰特·丘吉尔（Grant Churchill）和哈维尔·冈萨雷斯-梅索（Javier González-Maeso）提供的专家建议和帮助，感谢利兹·通布里奇（Liz Tunbridge）对手稿的评论，感谢莎拉·阿特金森（Sarah Atkinson）为编写参考。AGB由阿方索·马丁·埃斯库德罗基金会的奖学金资助。

脚注

利益冲突声明：作者声明，与本文的研究、作者身份和/或出版没有潜在的利益冲突。

基金：作者透露，获得了以下财务支持，用于本文的研究、作者身份和/或出版：这项工作由威康信托基金（战略奖102616）和医学研究委员会（G0801747）资助，并由NIHR牛津健康生物医学研究中心提供支持。所表达的观点是作者的观点，而不一定是NHS、NIHR或卫生部的观点。

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文章来自精神药理学杂志（英国牛津）由以下人员提供SAGE出版物