SMARCA4系统-失活突变增加非小细胞肺癌对极光激酶A抑制剂VX-680的敏感性

TPX2是非小细胞肺癌细胞灭活所必需的SMARCA4系统

为了排除库中混合siRNA双工体的离靶效应的可能性，我们获得了单个siRNA，用TPX2敲除来确认我们的筛选结果。我们首先用这些单个siRNA转染后检测TPX2蛋白水平(图2b). 四种siRNA中的三种成功地减少了TPX2蛋白(图2b)而这些siRNAs单独诱导了显著的毒性作用(图2c)并诱导PARP裂解(图2d). 为了研究TPX2耗竭对有丝分裂的影响，我们测定了组蛋白H3的磷酸化程度，该组蛋白仅在有丝分裂期间磷酸化²⁷在用非靶向siRNA处理的非同步细胞群体中，观察到非常低水平的磷酸化组蛋白H3，与任何时候进行有丝分裂的细胞群体的2-3%一致。然而，三种siRNAs靶向处理的细胞样本TPX2型组蛋白H3磷酸化显著增加(图2d). 这表明TPX2的缺乏导致有丝分裂的延迟退出或细胞周期停滞。为了将我们的观察扩展到更大范围的非小细胞肺癌株系，我们测试了两种最有效的单个siRNA靶向TPX2型再加两个SMARCA4系统-突变体和两个SMARCA4系统-野生型非小细胞肺癌细胞系。作为阳性对照，在本次和随后的基因敲除细胞活性实验中，有丝分裂激酶PLK1的缺失被用于监测对有丝分裂抑制剂的一般敏感性。我们的结果表明，两种siRNAs都以TPX2型在SMARCA4系统-突变株系与野生型NSCLC株系的比较SMARCA4系统(图2e). 表达野生型的细胞SMARCA4系统不仅对有丝分裂抑制剂的敏感性较低，因为所有这些NSCLC细胞株对细胞凋亡的抑制作用都相似PLK1我们进一步测量了本研究中使用的26个NSCLC和HBEC细胞系的细胞倍增时间，但我们没有观察到统计上的显著差异(P（P）=0.08，单因素方差分析（ANOVA）和事后（post-hoc）Dunnett的多重比较试验）在SMARCA4-null和SMARCA4-野生型非小细胞肺癌株系之间的平均倍增时间(补充表1).

SMARCA4丢失对AURKA耗竭或抑制敏感

当TPX2在有丝分裂中结合并激活AURKA时，我们用四个单独的siRNAs耗尽AURQA蛋白，以确定最有效的siRNA以供进一步实验(图3a). 在四个siRNAs中，只有一个显示出AURKA的完全敲除，而其中两个导致部分缺失。只有最有效的siRNA使细胞生长减少了50%以上，表明低水平的AURKA支持细胞存活(图3b). 由于其更高的功效，我们在以下实验中使用siRNA#28耗尽AURKA。耗尽AURKA诱导NCI-H1819细胞有丝分裂阻滞和凋亡(图3c). 为了了解对AURKA耗竭的敏感性是否与SMARCA4丢失有因果关系，我们恢复了野生型SMARCA4系统在NCI-H1819细胞系中的表达(图1b)并对亲代和表达SMARCA4的NCI-H1819细胞进行了相同的细胞毒性试验。外源性SMARCA4的表达显著降低了对AURKA敲除的反应(图3d)和VX-680(补充图10). 我们还测定了引入野生型后NCI-H1819细胞的生长速度是否发生变化SMARCA4系统用表达野生型SMARCA4的逆转录病毒载体转导的NCI-H1819细胞的倍增时间为56.9 h、 用空逆转录病毒载体56.1转导的H1819细胞系 h和亲代NCI-H1819细胞54.5 h.因此，表达H1819-的SMARCA4对AURKA缺失的敏感性降低并不是因为进入有丝分裂的频率降低。

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图3

NCI-H1819中SMARCA4表达缺失会增加siRNAs对AURKA的毒性。

(一)在用非靶向或AURKA靶向siRNA转染细胞后3天收集NCI-H1819细胞裂解物，并进行免疫印迹以监测AURKA蛋白水平。(b条)将单个siRNAs转染NCI-H1819细胞五天后，用CellTiter-Glo法对三份生物复制品进行细胞活力测定。PLK1敲除物作为阳性对照。带有s.d.的平均值如图所示。*表示统计显著性(P（P）<0.001），**表示统计显著性(P（P）<0.001），并具有较高的生物学意义（生存率<50%）。(c（c）)用单克隆抗体对裂解的PARP、磷酸氢istone H3和β-肌动蛋白进行免疫印迹，以评估AURKA耗竭的反应。(d日)在耗尽NCI-H1819、NCI-H11819-pBABE和NCI-H1829-pBABE-SMARCA4-FLAG细胞中的AURKA五天后，用CellTiter-Glo分析测定细胞活力(b条). (e（电子）)用靶向AURKA的非靶向或单个siRNA#28转染NCI-H1819、NCI-1299、NCI-H23、HCC827和Calu-1细胞5天后，用CellTiter-Glo活性测定法测定细胞活力，如图2PLK1被耗尽作为阳性对照。图上的误差条是三次生物复制的平均值的标准差。通过单因素方差分析和事后（post-hoc）Dunnett的多重比较测试。

接下来我们耗尽了奥卡在另外四条非小细胞肺癌生产线中，两条SMARCA4系统突变体和两个SMARCA4系统野生型，之前用siRNAs对TPX2型。我们观察到SMARCA4系统当AURKA耗尽时，突变株系的细胞生长或存活率显著下降，而SMARCA4野生型系则不敏感(图3e). SMARCA4状态不能确定对其他靶向有丝分裂激酶的毒性siRNA池的敏感性PLK1因此，对有丝分裂的抑制没有普遍的敏感性。这些结果表明，SMARCA4缺失可能会使细胞对AURKA靶向治疗产生特异性敏感性。

为了检验这种可能性，NCI-H1819细胞被五种结构不同的、市售的AURKA抑制剂处理，所有这些都已在临床试验中。NCI-H1819细胞对所有这些都敏感，其中VX-680和MLN8237在低纳米摩尔浓度下最有效(表1). 然而，远高于EC50，在高纳摩尔和低微摩尔浓度下，MLN8237显示出从细胞毒性到细胞抑制反应的意外转变，这表明它可能具有额外的靶标，在诱导细胞周期停滞方面可能比细胞死亡更有效(补充图1a). 考虑到在癌症治疗中持续细胞毒性表型相对于细胞毒性的验证优势²⁸，我们选择VX-680进行以下实验。

VX-680对NCI-H1819细胞产生显著毒性，EC50约为50 纳米(表1,图4a)而永生化正常人支气管上皮HBEC30-KT细胞对VX-680治疗有抵抗力(图4a). 为了确定SMARCA4缺失与AURKA抑制敏感性相关的程度，我们测量了NSCLC和HBEC株对VX-680的敏感性SMARCA4系统-野生型或突变型(补充数据3)因此，分别表达或缺乏SMARCA4蛋白(图4b). 与表达野生型SMARCA4的NSCLC株和HBEC株相比，所有突变株对VX-680都敏感(图4c). 为了确定SMARCA4激活的非小细胞肺癌细胞系对VX-680的细胞毒性反应是否是由于普遍易受任何毒素的影响，我们同时筛选了我们的NSCLC和HBEC细胞系小组，其中包括七种属于不同类别抗癌药物的其他药物，以及一种普通化学毒素(补充图2a–h,补充数据3). 在这个比较筛选中，我们使用了紫杉醇和GSK923295药物作为抗有丝分裂药物抑制靶点，以调节不同于VX-680的细胞分裂；培美曲塞和足叶乙甙分别作为靶向核苷酸代谢和拓扑异构酶II活性的替代化疗药物；Erlotinib和Crizotinib作为酪氨酸激酶受体靶向治疗药物，Bortezomib作为抑制蛋白酶体活性的抗癌药物。布雷费尔丁A抑制从高尔基体到内质网的小泡运输，这对所有细胞类型都至关重要。除Brefeldin A和GSK923295外，所有这些药物都是美国食品和药物管理局批准的癌症治疗药物，GSK9232.95是目前在临床试验中测试的靶向治疗药物候选药物。在相同的条件下，在相同的微孔板上用相同的细胞数对这九种药物进行剂量反应，以减少实验变量，并在不同的日子重复两次实验。96天后测量细胞活力 h、 计算每个药物/化学品和每个细胞系的EC50值。将所有细胞系的平均EC50值分为SMARCA4突变型、SMARCA4wild型和HBEC类型，并在图4c和补充图2a–h。未观察到受试细胞系的SMARCA4状态与其对VX-680以外的药物的反应模式之间的相关性，表明SMARCA4-inactivated NSCLCs对VX-660选择性地更敏感，但对其他抗癌药物或细胞毒素不敏感。

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图4

优先细胞毒性SMARCA4系统-用AURKA抑制剂VX-680处理后的突变细胞。

(一)用一系列浓度的VX-680处理NCI-H1819和永生化支气管上皮细胞系HBEC30-KT，并用CellTiter-Glo法测定细胞活力。数据是带有s.d的三次生物复制的方法。一些误差条小于数据符号。(b条)收集26个NSCLC和HBEC株的细胞裂解物，并进行免疫印迹以监测SMARCA4水平。两组免疫印迹均使用SMARCA4-null NCI-H1819和SMARCA4-野生型HBEC30-KT作为对照。(c（c）)用VX-680对一组NSCLC和HBEC细胞系进行重复、独立的剂量-反应实验，并显示其个体反应的平均EC50。水平条表示样本组的中位数。(d日)SMARCA4空NCI-H1299细胞和(e（电子）)将SMARCA4-wild型HCC827细胞异种移植到NOD/SCID小鼠上。每天两次静脉注射VX-680治疗。对于每个剂量组(n个=4），肿瘤体积平均值和s.e.m.用水平线表示。0的平均值之间差异的重要性 毫克 公斤⁻¹并通过单因素方差分析计算第17天的每个给药方案的事后（post-hoc）Dunnett的多重比较测试。

为了确定这种差异毒性是否受到细胞培养条件的影响，我们选择了两个非小细胞肺癌细胞系，一个是SMARCA4-null，NCI-H1299，另一个是野生型SMARCA4，HCC827，以确定异种移植物对VX-680的敏感性。选择这些细胞系是因为它们在NOD/SCID小鼠异种移植时有形成肿瘤的能力^29,30。我们测试了5至50范围内的五种不同给药方案 毫克 公斤⁻¹，每天服用两次，以确定对VX-680的反应程度。NCI-H1299对VX-680治疗高度敏感，而HCC827对任何剂量均无反应(图4d，e). NCI-H1299肿瘤即使在剂量为5 毫克 公斤⁻¹，低于此代理以前的报告^25,31,32(图4d).

试剂

VX-680（Chemietek，CT-VX680）GSK923295（ChemSene，CS-0056）紫杉醇，（LC Labs，P-9600），培美曲塞（LC Lab，P-7177），依托泊苷（LC Labs，E-4488），埃罗替尼（LC Lab斯，E-4497），克雷佐替尼（LC Labs，C-7900），硼替佐米（Alfa Aesar，J60378）和布雷费尔丁A（LC LabsB-8500）以粉末形式购买，并储存在20 −20时二甲基亚砜（DMSO）中的mM库存浓度 摄氏度。TPX2（Biolegend，鼠单抗，628001，1:1000稀释），AURKA（细胞信号，兔单抗，4718，1:1000稀），磷酸组蛋白H3（细胞信号学，兔单克隆抗体，33770，1:1000倍稀释），裂解PARP（细胞信号化，兔单抗体，9541，1:1000稀释剂），FLAG，SMARCA4/BRG1（EMD Millipore，大鼠mAb，MABE60，1:1000稀释）、DLG7/HURP（Bethyl Laboratory，A300-852A，1:1000稀释）、c-MYC（Santa Cruz Biotechnology，小鼠mAb，sc-40，1:1000稀释）和β-肌动蛋白（MP Biomedicals，小鼠mAb，69100，1:10000稀释）抗体用于免疫印迹分析。采用PCM1（Cell Signaling，rabbit pAb，5213，1:500稀释）、Tubulin（Abcam，rat mAb，ab6160，1:500溶解）、Alexa Fluor 488山羊抗鼠抗体（ThermoFisher，A-11006，1:1000稀释）和Alexa Fuor 568山羊抗兔抗体（ThermaFisher、A-11011，1:1000溶解）进行免疫荧光检测。pBABE-SMARCA4-FLAG质粒是Robert Kingston（Addgene质粒编号1959）赠送的。该质粒最初在Sif中报道等.⁵⁹并包含全长SMARCA4编码区域。pBABE-空质粒是Jerry Shay实验室（美国德克萨斯州达拉斯UT西南医学中心）赠送的礼物。

高通量全基因组siRNA文库筛选

siRNA库购自Dharmacon（GE Healthcare，Inc.）。siRNA文库设计为拥有21124个由4个单独siRNA组成的库，靶向人类基因组中大约85%的所有已识别基因。利用非靶向siRNA和靶向PLK1的siRNA优化NCI-H1819细胞系的转染条件，以分别达到最小的非特异性毒性和最大的特异性毒性。对于每个基因靶点，siRNA池排列在第2-7列的96个板中。第1列和第8列仅包含转染试剂。采用反向转染方案以最大限度地提高转染效率。siRNA池（最终浓度为50 nM）与RNAiMax转染试剂（0.23）混合 μl/孔）（Life Technologies，13778-150）在OptiMEM介质（GIBCO，31985）中根据优化的条件。使用自动液体分配器（BioTek MicroFlo；Thermo-Fisher，Inc.）将总共3000个细胞分配到微孔中。每个池筛选三份。细胞培养96 37小时 °C，存在5%CO₂然后，在30时将培养基倒置离心，去除培养基克对于1 使用制造商的方案，使用CellTiter-Glo（Promega，G7573）分析法测量细胞活力。

次要低吞吐量确认屏幕

Dharmacon（GE Healthcare，Inc.）提供了一个定制的siRNA库，其中包含针对38个人类基因中每个基因的4个单独siRNA。转染条件和方法与高通量筛选相同。感兴趣的siRNA是根据统计和生物学意义定义的。统计显著性定义为P（P）通过单因素方差分析和事后（post-hoc）Dunnet的多重比较测试。生物学意义被任意定义为，与转染非靶向siRNA的细胞的平均值相比，通过CellTiter-Glo分析测定的5天后细胞存活率下降50%。在后续实验中，对确定具有统计学和生物学意义的命中进行了调查。

微板凋亡试验

siRNA池的转染与96 well板格式的高通量和低通量文库屏幕的转染方式相同。转染72小时后，通过在30℃的液体收集容器中倒置离心试验板，去除培养基克对于1 最小Caspase 3和/或7活性通过购买Promega（G8090）的Caspase-Glo 3/7分析进行评估。siRNAs证明P（P）通过单向方差分析得出<0.01的值事后（post-hoc）Dunnet的多重比较试验被认为与非靶向siRNA转染细胞相比具有统计学意义。

siRNA与细胞活性测定的确认

用于敲除TPX2、AURKA、HURP和PLK1的单个或合并的siRNA购自Dharmacon。将其在无DNAse/R酶的水中溶解过夜，使最终浓度为5 微米。采用反向转染以最大限度地提高转染效率。最终浓度为50的siRNA池 将nM与RNAiMax转染试剂（Life Technologies，13778-150）混合在OptiMEM培养基中，并分配到孔中，孔中添加1000-2000个细胞。将转染细胞培养120天后 h、 培养基在30时通过倒置离心板去除克对于1 用CellTiter-Glo法测定细胞活力。对每个siRNA进行三重生物复制试验。

生成SMARCA4表达细胞系

将pBABE-Empty或pBABE-SMARCA4-FLAG质粒转染到Phoenix逆转录病毒产生细胞中，收集含有逆转录病毒的上清液。感染NCI-H1819细胞，并用嘌呤霉素选择含有逆转录病毒的细胞。细胞被扩展为异质性群体。用单克隆FLAG和SMARCA4抗体进行western blotting，证实SMARCA4s的表达。

蛋白质印迹

总计2×10⁵用浓度为50的单个siRNA转染细胞 nM，六孔格式。转染72小时后，抽吸培养液并用PBS清洗细胞。细胞在RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris缓冲液pH值8150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%钠、0.1%十二烷基硫酸钠、0.5%脱氧胆酸钠）补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。细胞裂解物的蛋白质浓度采用蛋白质DC分析法进行测量（Bio-Rad，500-0111）。用单克隆抗体免疫印迹法监测内源性TPX2、AURKA或HURP水平、组蛋白H3磷酸化和β-肌动蛋白表达，作为内部对照。

NSCLC细胞和HBEC在70–80%融合后，在RIPA裂解缓冲液中进行裂解（50 mM Tris缓冲液pH值8150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%钠、0.1%十二烷基硫酸钠、0.5%脱氧胆酸钠）补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。用蛋白DC法测定细胞裂解物的蛋白浓度。用单克隆抗体免疫印迹法监测内源性SMARCA4、HURP、AURKA、TPX2、RAN或MYC水平和β-肌动蛋白表达，作为内部对照。用ImageQuant软件测量蛋白质带强度。

中提供了所有斑点的非剪切扫描补充图12.

免疫荧光分析

用4%甲醛在PBS中固定盖玻片上的细胞15 室温下的最小值。用PBS洗涤后，用0.25%Triton-X在PBS中渗透细胞15 室温下的最小值。用PBS清洗后，盖玻片与10%BSA封闭溶液孵育1 h.接下来用抗PCM1和抗Tubulin抗体对24个细胞进行联合免疫染色 h.清洗样品，并用Alexa Fluor次级抗体进一步处理1 h.清洗后，使用DAPI（Sigma，F6057）安装试剂将盖玻片安装在显微镜载玻片上。在EVOS FL细胞成像系统上进行显微镜观察。计算并绘制出总细胞群（DAPI和Tubulin阳性细胞）中具有中心体PCM1的细胞分数。

微孔板药敏试验

将NCI-H1819细胞（3000个/孔）接种在96孔板中，并在37 24°C h.用载体（DMSO）处理或连续稀释所示化合物的9种浓度，从1到33300 nM分三次进行（所有井的最终DMSO浓度=0.34%）。120之后 h、 取下培养基，用CellTiter-Glo法测定细胞活力。

在384孔板格式下，对含有VX-680、紫杉醇、GSK923295、培美曲塞、足叶乙甙、埃洛替尼、克雷佐替尼、硼替佐米和布雷费尔丁A的NSCLC和HBEC细胞系进行了剂量-反应研究。细胞以每孔1000–1500个细胞的密度进行电镀，并在37℃下培养过夜 °C，如上所述。药物/化学品在二甲基亚砜中的剂量为12个浓度，范围为50 pM至50 μM（半对数稀释），一式三份。37℃孵育细胞后 96°C h、 用CellTiter-Glo法测定细胞活力。在不同的日子对九种药物进行了两次对比试验。评估每个细胞系对每种药物的剂量反应，并用五参数logistic方程计算EC50值。

小鼠异种移植物研究

将来自人类非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299和HCC827的细胞进行胰蛋白酶化，并收集在添加10%胎牛血清（v/v）的RPMI 1640培养基中。细胞在1000℃下离心克媒体被吸引了。用消毒过的PBS洗涤两次后，将细胞重新悬浮并在PBS中稀释至2.5×10⁶每100个单元格 μl浓度。单细胞悬浮液（100 μl）注射到8-10周龄雌性NOD/SCID小鼠的右侧。将NCI-H1299和HCC827细胞异种移植的小鼠保存在UT Southwestern动物资源中心保存的无菌动物饲养场中。用卡尺测量肿瘤体积，每周测量两次，计算公式为：肿瘤体积=（长×宽²)/2. 当肿瘤的平均体积达到150–200时，开始VX-680治疗 毫米^三根据肿瘤体积进行分类后，将小鼠分为蛇纹石型治疗组。在评估实验时未使用盲法。VX-680是用50%PEG-300（Sigma，90878）在PBS中配制而成。对于每一剂量的VX-680-每种细胞系，使用四只小鼠的氙气。小鼠腹腔注射0、5、10、20、30和50 毫克 公斤⁻¹VX-680每天两次。选择这个数字是为了限制使用的动物数量，因为这两种细胞系的反应差异在这个组的大小上没有统计学意义，但在生物学上也不显著。当最大肿瘤达到1500毫米时，实验终止^三根据UT西南大学动物护理和使用委员会批准的方案进行动物研究，该方案符合《动物法案》PL99-158（修订版）的要求和《实验动物护理和应用指南》中规定的指南。

基因拷贝数变异分析

使用DNeasy Tissue Kit或RNeasy Plus Mini Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）从细胞系中提取基因组DNA或总RNA。根据制造商的协议，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）通过RNA逆转录制备cDNA。

全转录组鸟枪测序（RNA测序）

Wang详细描述了RNA测序和质量控制评估的程序等.⁶⁰

RNA-Seq比对和量化

使用FastQC（Babraham生物信息学研究所）检查测序质量，并使用STAR（v2.4.2）将高质量读数与基因注释数据（基因编码v19）一起映射到人类参考基因组（hg19）⁶¹RSeQC用于评估RNA样品质量⁶²Cufflinks报告的基因级表达是以每千碱基百万读片段数为单位的⁶³。原始RNA-seq数据将在接受本手稿后存入SRA数据库。

Illumina humanWG BeadChip微阵列分析

微阵列分析的描述已发布⁶⁴数据作为{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE32036”，“term_id”：“32036”}}天然气32036.

TCGA肿瘤数据集

从cBioportal数据库和搜索平台获得肺腺癌基因组和RNA测序数据。对RSEM表达数据进行log2转换。P（P）使用了数据库提供的值。

这项工作得到了Lizanell和Colbert Coldwell基金会、德克萨斯州癌症预防和研究所RP110708、国家癌症研究所U01CA176284和P50CA70907以及自由呼吸影响奖的资助。这部分是在国家研究资源中心拨款C06-RR15437支持的设施中进行的。西蒙斯癌症中心和NCI P30CA142543提供资金支持HTS核心实验室开展的工作。我们感谢Bercin Kutluk Cenik和Jason Toombs对动物研究的帮助。