人类小脑多蛋白的被动清晰度和免疫荧光标记研究进展：了解线粒体疾病中神经退行性变的机制

小鼠小脑

为了优化脑组织的水凝胶包埋，我们使用了五只12个月大的野生型C57/Bl6小鼠的预切小脑和整个小脑。水凝胶孵育3天后，4 °C，样品转移至37 °C水浴以启动聚合。4之后 数小时后，水凝胶聚合，在组织周围形成牢固的水凝胶基质。从多余的水凝胶基质中切除组织对整个小脑来说很简单，而预先切除的小脑很容易受损。因此，为了进一步处理，只将整个小脑样品嵌入水凝胶中，聚合，然后以不同的截面厚度（250–500 μm）。

最近的一些研究已经确定了基于电泳的主动清除技术的问题以及由此导致的组织损伤^9,10鉴于此以及被动清除技术最近的成功^4,11，我们选择使用被动清除方法。在37℃的清除缓冲液中培养，可变截面厚度的小鼠小脑变得透明 °C持续7天(图1a). 在清洁溶液中被动培养后，组织扩张明显增加图1a之前，其他人已经使用被动和主动清除过程报告了这一点，并且在成像前将样品浸入安装溶液中，对细胞形态或蛋白质含量没有负面影响时，这一点就会得到解决^三,4.

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图1

在野生型小鼠脑切片上演示被动清晰度和优化免疫荧光标记条件。

12个月大的野生型C57/Bl6小鼠小脑切片的代表性图像显示了被动清除前后的不同厚度(一). 被动清除的小脑切片用针对孔蛋白（绿色）、神经丝H（NF-H；红色）和髓鞘碱性蛋白（MBP；紫色）的抗体进行免疫荧光标记。对免疫标记方案的各种条件进行了测试；(b条)硼酸钠缓冲液37 24°C 小时(c（c）)硼酸钠缓冲液4 初级抗体的温度为6天，然后为4天 对于次级抗体，持续4天(d日)PBST为4 初级抗体的温度为6天，然后为4天 对于二次抗体，在°C下持续4天；（e）被动清除组织切片的优点在未清除的切片中得到了例证，该切片是在(d日). 比例：100 微米。

被动清除250的免疫荧光方案的优化 μm小鼠小脑切片

Chung的原始研究等使用染色方案，在硼酸钠（SB）缓冲液中稀释初级和次级抗体，并在37 24°C 每个小时，12小时 中间要洗一个小时^三为了测试这种方法，我们使用抗体标记神经元及其过程（抗神经丝H 200 kDa（NF-H））、髓磷脂（抗髓磷脂碱性蛋白（MBP））和线粒体（抗孔蛋白），因为这些抗体在5 μm截面(补充图1). 复制钟和同事的方法，我们发现使用250个已清除的部分 μm厚度，并与在37℃SB缓冲液中稀释的抗体一起孵育 24°C 小时只对神经丝H进行了弱染色，而髓鞘碱性蛋白和孔蛋白几乎完全没有染色(图1b). 为了改进免疫荧光标记，我们将温度降低到4 °C，因为较低的温度增加了抗体结合的特异性，并将一级抗体的孵育时间延长至6天，二级抗体的孵化时间延长至4天。在本试验中，我们比较了SB缓冲液和PBS与0.1%吐温-20（PBST）作为稀释剂的使用。两个SB缓冲器(图1c)和PBST(图1d)在较低温度下延长孵育期，可产生线粒体、神经元、轴突和髓鞘的特异性染色。然而，SB缓冲液在溶液中和低温下的截面上都形成了晶体。因此，我们使用PBST中稀释的一级抗体，并在4 °C持续6天，然后在4℃下对PBST中的次级抗体进行广泛清洗和稀释 小鼠切片免疫荧光染色4天。为了确认清理的必要性，我们使用4 °C延长培养步骤(图1e)髓磷脂染色弱，线粒体或神经元标记缺失。

被动清除小鼠小脑切片中抗体渗透性差

不同厚度的免疫荧光标记切片的共焦成像显示抗体渗透问题，在300以上明显减少 微米(补充图2). 初始和最终z堆叠到150 切片中的μm显示出强烈而均匀的染色，朝着切片中部显著减少。安藤之前的一项研究中观察到抗体渗透性差等.⁵为了提高组织的渗透性，我们测试了PBS-Triton X和蛋白酶K（10 mg/ml）溶液10 分钟¹²然而，蛋白酶K处理导致组织崩解，PBS-Triton X的改善最小。因此，本研究的剩余部分使用250 μm厚的截面。

小鼠组织中可靠抗体的优化

概述的免疫染色方法显示小脑皮层的神经元、髓磷脂和线粒体被标记，但我们现在想确认是否有可能标记小脑的其他成分(图2). 为了明确显示Purkinje细胞体，我们标记了钙结合蛋白（抗钙结合蛋白D-28k）和小脑Purkinje细胞表达的钙结合蛋白。这两种抗体都能对Purkinje细胞体产生特异性标记(图2a、b，白色箭头）和钙结合蛋白也标记Purkinje细胞的树突(图2a，白色箭头）。为了记录Purkinje细胞连接的变化，Purkinje细胞轴突用NF-H标记(图2c，白色箭头）和磷酸化神经丝(图2d，白色箭头）观察浦肯野细胞轴突从浦肯野细胞层通过颗粒细胞层投射到深白质。通过标记MBP也可以观察到颗粒细胞层中Purkinje细胞轴突周围的髓鞘(图2e，白色箭头）。为了观察线粒体，使用了针对外膜蛋白、孔蛋白（抗孔蛋白）和线粒体呼吸链复合物的亚基、复合物IV亚基I（抗COXI）产生的抗体，并显示出阳性免疫反应性(图2f). 以下给出了所有最佳抗体条件表1.

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图2

被动清除250μm小鼠小脑中神经元、轴突和线粒体蛋白的免疫荧光标记的代表性图像。

被动清除250 μm野生型小鼠小脑切片染色，检测小脑中常见的神经元和线粒体蛋白。钙结合蛋白((一); 红色；546 nm）和小白蛋白((b条); 紫色；647 nm）抗体阳性标记Purkinje细胞体。通过阳性神经丝标记观察浦肯野细胞轴突((c（c）); 红色；546 纳米；NF-H和(d日); 红色；546 纳米；SMI-31）和髓磷脂((e（电子）); 紫色；647 纳米；MBP）。通过COXI蛋白阳性标记检测线粒体((（f）); 紫色；647 纳米；COXI）。比例尺：100 微米。

人类小脑切片

我们将我们的优化方法应用于人类小脑，以可视化控制个体内的连接(n个==========================================================2） 以及临床和基因证实的线粒体疾病患者(n个==========================================================5). 人类小脑切片需要在清洗液中培养更长时间才能变得透明，组织至少需要四周才能清洗干净(图3a). 清除的时间长短对于达到染色质量至关重要，因为仅清除2周的切片显示应用的三个标记物（抗COXI、抗NF-H和抗MBP；图3b). 只有一小部分髓鞘被标记，而数量有限的轴突也被标记。然而，当被动清除的时间延长到四周时，颗粒细胞层的髓鞘有广泛的标记，浦肯野细胞体的线粒体有清晰的标记，轴突密度较高(图3b).

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图3

演示不同神经元亚室、血管和线粒体的被动清晰度和免疫荧光标记。

250 37岁时，对来自对照个体和线粒体疾病患者的μm人小脑切片进行了被动清除 °C持续4周(一). 免疫荧光染色的质量取决于被动清除的持续时间；2周的被动清除使颗粒细胞层（NF-H；绿色；488 nm和MBP；红色，546 nm），线粒体无标记（COXI；紫色；647 纳米；(b条)). 将被动清除延长至4周可提高可识别浦肯野细胞及其轴突的染色质量（NF-H，绿色；488 nm）及其髓鞘（MBP；红色，546 nm）和线粒体（COXI；紫色；647 纳米；(b条)). 小脑被动清除四周后，线粒体（COXI；紫色；647 nm）和有髓浦肯野细胞轴突（NF-H；绿色；488 nm和MBP；红色；546 nm）是线粒体疾病对照组和患者死后的人类小脑组织(c（c）). 使用抗体组合，可以标记神经元并追踪其三维投射，包括浦肯野细胞（NF-H）、轴突（NF-H和MBP）及其树突树突（NF-H(d日)). 还可以检测血管网络（谷氨酸-1和α-平滑肌肌动蛋白(d日)). 比例：100 微米。

抗COXI、抗NF-H和抗MBP应用于被动清除的250 以PBST为稀释剂的μm人小脑切片 将初级和次级抗体分别培养6天和4天。从这7例病例中，结果好坏参半。NF-H和MBP均呈阳性标记，使对照1和患者2、4和5的颗粒细胞层中有髓浦肯野细胞轴突可视化(图3c). 而在对照组2、患者1和患者6中，没有任何抗体的特异性染色。我们不确定为什么这些组织的染色不成功，因为对照2的固定长度和死后间隔（PMI）为8年，PMI:39 小时），患者1（固定：6年，PMI:21 小时）和6（固定时间：2年，PMI:76 小时）在成功病例的范围内（唯一的例外是对照2，固定时间超过1年）（固定时间：3-7年，PMI:21-112 小时）。对照2显示488例中血管的非特异性染色和荧光团聚集 nm通道。患者3的NF-H和MBP都有一些特异性染色，但标记的只是较大较厚的轴突。

本研究中使用的人体切片在福尔马林中固定最长七年，而在其他研究中，组织固定六年^三,5,6。除了福尔马林固定切片外，刘和同事还应用了清晰研究发现，与福尔马林固定的大脑皮层切片（~60天）相比，新鲜大脑皮层切片被动清除所需的时间更短（~40天）。基于新鲜组织的成功以及在PFA中固定然后在NBTR中冷冻的人体组织的可用性，我们将CLARITY协议应用于PFA固定然后冷冻的人类小脑切片，而不是存档的福尔马林固定切片。PFA固定和冷冻切片（对照3）在6天内被动清除，切片中NF-H染色阳性(补充图3)证实了除了福尔马林固定切片外，PFA冷冻切片也是一种有用的资源。

被动清除人小脑切片的结构成像

由于我们能够看到人类小脑切片中的浦肯野细胞和线粒体，我们对被动清除的人类切片（250 μm）来可视化各种不同的细胞结构域，包括树突、轴突和血管网络(图3d). 用抗-NF-H标记Purkinje细胞及其树突(图3d)同时抗NF-H和抗MBP标记有髓轴突(图3d). 共焦图像被重建成3D堆栈，以便可视化两个结构的复杂过程。为了观察血管，分别使用抗α平滑肌肌动蛋白和抗glut-1作为平滑肌细胞和内皮细胞的标记物(图3d). 通过标记glut-1，在250个 在小动脉中观察到μm厚的切片以及glut-1和α平滑肌肌动蛋白的共定位。使用Imaris软件重建三维形态(补充视频1).

被动清除人小脑切片中线粒体的可视化

在成功可视化控制个体和线粒体疾病患者的轴突、树突和血管网络等大型结构后，然后，我们试图确定是否有可能在被动清除的小脑切片中可视化线粒体呼吸链蛋白，以确定线粒体呼吸链缺陷。

以前的研究使用线粒体质量标记物结合复合物I抗体来确定复合物I表达是否下调，这是线粒体呼吸链缺陷的标志^13,14在被动清除的对照切片中，结合线粒体质量标记物、孔蛋白和SDHA（针对复合物II）对复合物I亚基NDUFB8和NDUFA13进行测试。NDUFB8和NDUFA13与各自的线粒体质量标记物共定位，所有线粒体抗体均呈阳性染色，从而证实复合物I亚基的阳性和特异性染色(图4a). 神经元标记物NF-H被用作阳性对照，以确认免疫标记方案是成功的。

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图4

人类小脑浦肯野细胞神经元线粒体呼吸链缺陷的评估。

250 被动清除μm厚的小脑切片并进行免疫荧光标记，以确定线粒体质量（孔蛋白和SDHA，647 nm）和线粒体呼吸链内的复合物I亚单位（NDUFB8和NDUFA13；546 nm）与神经元标记物（NF-H；488 nm）在控制1中(一). 探讨Purkinje细胞中呼吸链缺陷（相对于线粒体质量而言复合物I亚单位丰度减少）及其在线粒体疾病神经元患者（NF-H；488 纳米），线粒体（孔蛋白；647 nm）和复合物I亚基（NDUFB8；546 nm）进行免疫荧光标记。对照Purkinje细胞显示NDUFB8蛋白相对于孔蛋白的匹配丰度（对照1和2），而患者Purkinje细胞和周围神经元显示NDUVB8蛋白相对于孔蛋白水平的缺失，证实这些细胞中存在复杂I缺陷线粒体（患者2和4(b条)). 比例：100 微米。

在成功标记线粒体蛋白后，我们比较了线粒体疾病患者和对照组受试者被动清除小脑部分的呼吸链缺陷。对照组1、对照组2和患者2的小脑切片（m.8344 A类>G） 和患者4(POLG公司)对NF-H（作为神经元标记物）、NDUFB8（复合物I标记物）和Porin（线粒体质量标记物）进行染色；图4b). 只有这些部分用于优化步骤，因为它们在每一轮免疫标记后始终产生最佳结果。在对照组中，NDUFB8和孔蛋白共定位，证实没有呼吸链缺陷。在这两名患者中，NDUFB8相对于通道蛋白有明显且全面的损失，这证实了患者的呼吸链缺乏。与孔蛋白相比，NDUFB8标记的丢失证实，在被动清除的切片中，可以看到多个神经元亚室线粒体中的呼吸链缺陷，重要的是，可以记录单个神经元中呼吸链缺陷的分布，它们的树突和轴突。

被动清除人小脑切片的四倍免疫荧光染色

以往关于死后脑组织线粒体呼吸链异常的研究主要集中在薄片上的免疫荧光染色¹⁴，这受到可以捕获的有关神经元及其投影的信息量的限制。使用250 μm澄清了患者小脑，我们测试了线粒体呼吸链复合体I和神经元及其相关有髓轴突线粒体质量的四重免疫荧光评估的可行性。为了达到这个目的，我们使用了两个线粒体标记；线粒体质量的复合物I亚单位（NDUFA13）标记和核编码复合物IV（COX4）标记，然后是NF-H和MBP，以识别神经元及其有髓轴突(图5). 使用的二级抗体与不同的荧光团结合，包括Alexa-405 nm（对于NF-H），Alexa-488 nm（用于COX4），Alexa-546 nm（对于NDUFA13）和Alexa-647 nm（MBP）允许不同蛋白质的光谱区分，这是405 nm荧光团被用于被动清除的组织块。最佳案例的结果如所示图5，有髓轴突复杂网络的特异染色清晰可见；COX4和NDUFA13在颗粒细胞层线粒体和Purkinje细胞体中阳性标记复合物I和IV，在对照1中显示良好的共定位。在患者组织中，两名患者2（m.8344 A类>G） 和患者3(POLG公司)与COX4相比，患者4的NDUFA13表达相似(POLG公司)与COX4相比，NDUFA13在Purkinje细胞体中的表达降低。这些观察结果与Chrysostomou及其同事之前的一项研究一致，该研究使用薄片中的免疫荧光来研究呼吸链缺陷¹³.

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图5

四重免疫荧光后人类小脑浦肯野细胞及其有髓轴突的代表性图像。

被动清除250 对人小脑切片进行μm厚的神经丝H（蓝色）、NDUFA13（红色）、COX4（绿色）和髓鞘碱性蛋白（紫色）染色。线粒体通过NDUFA13（红色）和COX4（绿色）的阳性标记清晰可见。Purkinje细胞轴突的髓鞘（髓鞘碱性蛋白，647）已被清楚标记。在405 nm通道中存在高水平的自体荧光，难以观察浦肯野细胞轴突（神经丝H）。405中存在自体荧光 nm和488 通过非一级抗体对照组证实了nm通道。比例：100 微米。

然而，405中有高水平的自体荧光 nm通道，未经初步对照证实，使NF-H染色难以可视化。在这些部分中，背景噪音很高，405中的血管清晰可见（白色箭头） nm通道。

人体组织

福尔马林固定小脑组织取自6名患有遗传和临床证实的线粒体疾病的患者（年龄范围：55-79岁）和2名没有神经疾病临床或病理证据的对照个体（年龄：72岁和77岁）（参见表2). 本研究中还使用了PFA固定和冷冻对照切片，没有神经疾病的临床或病理证据（对照3）。通过纽卡斯尔脑组织资源（NBTR）和切片（~3）获得组织 cm宽）从大的固定小脑切片中去除。4点在PBST中清洗节段 °C过夜。这项研究得到了纽卡斯尔和北泰恩赛德地方研究伦理委员会的批准。所有人类材料都是根据《赫尔辛基宣言》使用的。纽卡斯尔脑组织资源由纽卡斯尔大学人类组织管理局作为研究组织库的许可证涵盖。所有组织均在知情同意的情况下收集。

水凝胶制备

通过结合20 ml丙烯酰胺（40%，生物实验室），10 ml双丙烯酰胺（2%，生物实验室），1 g VA-044引发剂（0.25%w/v，Alpha Laboratories），40 ml 10 X PBS和310 毫升_d日H（H）₂O.这是在冰上完成的，然后储存在−20 °C直到需要。

组织包埋

组织放置在50 ml水凝胶溶液，4小时孵育3天（小鼠）或7天（人类） 摄氏度。孵化完成后，打开Falcon试管，将其置于干燥室中，在干燥室中充满氮气10次 分钟。然后用真空泵将干燥室中的所有气体抽走10分钟 再从储罐中注入氮气10分钟 分钟。猎鹰管被重新密封，确保暴露在大气中的可能性最小。猎鹰管被转移到37 3°C水浴 开始水凝胶聚合的时间。

被动组织清除

水凝胶聚合后，将组织放入通风橱中取出。组织在PBS中清洗过夜，然后切片至250 振动棒上的μm。通过结合24.722制备清洁溶液 g硼酸（Sigma-Aldrich），80 g十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich）和2升_d日H（H）₂通过添加NaOH将O和pH调节至8.5。250 μm切片放置在50 ml Falcon管，填充40 ml清洁溶液，然后放入37 °C水浴。每隔一天更换一次清洗液。被动清除的时间长度由眼睛评估，但小鼠为250 μm小脑切片通常在7天内清除，而人类则为250 μm小脑切片>4周。

免疫荧光染色

清理完成后，用PBS清洗各部分5次，共30次 分钟，并在4点保存在PBS中 °C，直到需要。然后将切片在正常山羊血清（10%v/v，Sigma-Aldrich）中孵育90 阻止二级抗体的非特异性结合。研究中使用的抗体的特性总结如下补充表2.

为了标记线粒体蛋白，对呼吸链缺陷标记物（NDUFB8和NDUFA13）进行生物素化。免疫标记方案包括将PBS中的主要抗体（NDUFB8、Porin和Neurofilament H或NDUFA13、SDHA和Neurovilament H）在4小时孵育6天 °C，然后在4 摄氏度。最后，在4天时应用荧光团（链霉亲和素、Alexa Fluor 546结合物、Alexa-Fluor 647抗鼠IgG2b和Alexa Fuor 488抗兔IgG或链霉亲和素或Alexa Fluor 546conjugate、Alexa-Fuor 647抗鼠IG1和Alexa-Fluro 488抗家兔IgG）4天 °C，然后进行成像处理。

这项工作得到了Wellcome信托基金（074454/Z/04/Z）和Straker慈善信托基金的支持。本研究的组织由纽卡斯尔脑组织资源提供，该资源部分由英国医学研究委员会（G0400074）的拨款资助，NIHR纽卡斯尔生物医学研究中心和单位根据Tyne NHS Foundation Trust和纽卡斯尔大学授予纽卡斯尔，阿尔茨海默病协会和阿尔茨海默氏病研究信托基金会的资助，作为痴呆症大脑研究项目的一部分。