自噬。2014年8月1日；10(8): 1403–1414.
自噬和HDAC联合抑制
羟基氯喹联合HDAC抑制剂伏立诺达治疗晚期实体瘤患者的I期安全性、耐受性、药代动力学和药效学分析
,1,†* ,1,2,† ,1 ,1 ,三 ,4 ,1,2 ,1 ,1 ,1 ,1,5和1,6,*
德瓦林加姆·马哈林根
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
莫妮卡·米塔
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
2Cedars-Sinai医疗中心；加利福尼亚大学，洛杉矶；美国加利福尼亚州洛杉矶
约翰·萨兰托普洛斯
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
莱斯利·伍德
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
拉维·K·阿马拉瓦迪
三艾布拉姆森癌症中心和医学部；宾夕法尼亚大学；美国宾夕法尼亚州费城
阿兰·米塔
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
2Cedars-Sinai医疗中心；加利福尼亚大学，洛杉矶；美国加利福尼亚州洛杉矶
泰勒·J·居里
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
克劳迪娅·马斯皮蒂亚
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
史蒂芬·T·纳罗基
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
弗朗西斯·贾尔斯
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
5Robert H Lurie综合癌症中心；西北大学；美国伊利诺伊州芝加哥
詹妮弗·S·卡鲁
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
6陶西格癌症研究所；克利夫兰诊所；美国俄亥俄州克利夫兰
1德克萨斯大学健康科学中心癌症治疗与研究中心；美国德克萨斯州圣安东尼奥
2Cedars-Sinai医疗中心；加利福尼亚大学，洛杉矶；美国加利福尼亚州洛杉矶
三艾布拉姆森癌症中心和医学部；宾夕法尼亚大学；美国宾夕法尼亚州费城
4科学大学；美国宾夕法尼亚州费城
5Robert H Lurie综合癌症中心；西北大学；美国伊利诺伊州芝加哥
6陶西格癌症研究所；克利夫兰诊所；美国俄亥俄州克利夫兰
†这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2013年11月21日收到；2014年5月9日修订；2014年5月14日接受。
- 补充资料
其他材料。
GUID:90FB9967-9809-4FF6-909B-0AA04260CF97
摘要
我们之前报道过，通过组织蛋白酶D介导的机制，抑制自噬显著增强组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂伏立诺达（VOR）的抗癌活性。因此，我们进行了首次人体试验，以研究自噬抑制剂羟基氯喹（HCQ）和VOR联合治疗晚期实体瘤患者的安全性、初步疗效、药代动力学（PK）和药效学（PD）。在本研究中接受治疗的27名患者中，有24名患者被认为可以对研究评估和毒性进行全面评估。患者每天口服递增剂量的HCQ（QD）（21天周期中的第2天到第21天），同时每天服用400 mg VOR（一天到21天）。与治疗相关的不良事件（AE）包括1至2级恶心、腹泻、疲劳、体重减轻、贫血和肌酐升高。少数患者出现3级疲劳和/或骨髓抑制。疲劳和胃肠AE是剂量限制性毒性。600毫克HCQ和400毫克VOR被确定为最大耐受剂量和推荐的II期方案。一名肾细胞癌患者有持续的部分缓解，2名结直肠癌患者有长期稳定的疾病。添加HCQ对VOR的PK谱没有显著影响。与外周血单个核细胞相比，肿瘤活检中CDKN1A和CTSD的表达与治疗相关的增加更为显著。基于这种组合的安全性和初步疗效，目前正在计划进行更多的临床研究，以进一步研究自噬抑制，作为提高HDAC抑制剂疗效的新方法。
关键词：自噬、癌症、临床试验、羟基氯喹、伏立诺达
介绍
自噬是一种进化上保守的降解过程，用于细胞器和具有长半衰期的蛋白质子集的周转。它还作为营养循环的基本机制，产生基本的生物化学构件和代谢燃料的替代来源，在细胞应激期间维持细胞存活。1,2在过去十年中，深入的研究有助于更好地确定自噬在癌症中的作用。三关键研究表明，自噬降解在恶性疾病发病机制中的具体作用明显依赖于环境。在癌前状态下，自噬可以阻止缺陷细胞增殖，从而可能获得促进肿瘤发生的额外突变/缺陷。相反，在晚期癌症的情况下，自噬似乎主要作为一种机制发挥作用，在压力条件下促进细胞存活，而压力条件是肿瘤微环境的特征，包括缺氧和营养缺乏。三除了内源性应激外，辐射治疗和多种作用机制不同的抗癌治疗药物也会诱导自噬。4大量证据表明，这种现象通过提高恶性细胞的生存能力而削弱了治疗效果。5-7这些集体发现为进一步研究自噬抑制作为一种提高癌症治疗疗效的新策略提供了有力的依据。
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一个由18个相关蛋白组成的家族，在基因表达的表观遗传调控中发挥着重要作用。HDAC促进乙酰基的去除，从而导致转录抑制。8多种HDAC的过度表达和/或过度激活是促进癌细胞表观遗传失调的机制，从而促进恶性进展和抗癌耐药性。因此，针对HDAC活性是许多癌症的一种诱人的治疗策略。迄今为止，已有许多不同的HDAC抑制剂作为抗癌药物进行了临床前和临床研究。药效学研究表明，HDAC活性的破坏可诱导肿瘤细胞的多效性效应，包括细胞周期阻滞、分化、血管生成减少、自噬和凋亡。9,10Vorinostat（VOR）是第一个获得FDA批准用于癌症治疗的HDAC抑制剂。它目前被用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，并且在晚期实体瘤患者中也表现出适度的活性。11
最近的许多研究都集中于确定HDAC抑制剂耐药的关键机制，其主要目标是更好地确定可能受益于此类药物治疗的患者，并制定新的策略来规避耐药。12-14我们之前发现HDAC抑制剂诱导的自噬显著减弱其抗癌活性。因此，在伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病和结肠癌模型中，自噬的遗传或药理学破坏协同调节VOR的促凋亡和细胞抑制作用。溶酶体蛋白酶CTSD水平的治疗性升高被确定为伏立诺达和自噬抑制剂氯喹（CQ）联合促凋亡作用的关键下游药效介质。15,16
CQ和羟基氯喹（HCQ）是FDA批准的药物，几十年来一直用于治疗疟疾、类风湿关节炎和狼疮。CQ和HCQ都通过破坏溶酶体功能来抑制自噬降解。5,6基于抑制自噬药物的临床可用性，以及我们的临床前数据表明，破坏自噬协同增强VOR活性，我们设计了第一个HCQ与口服，成人晚期难治性实体恶性肿瘤患者每日一次的VOR方案。我们的主要目标是确定该组合的安全性，确定最大耐受剂量（MTD）和推荐的II期剂量，并评估其初步疗效。我们还研究了HCQ对VOR药代动力学的潜在影响，并评估了HCQ加VOR在外周血单个核细胞（PBMC）和肿瘤活检标本中的药效学。
结果
患者、MTD和安全
采用标准的“3+3”I期临床试验设计，评估HCQ和VOR联合治疗晚期难治性实体瘤患者的安全性和初步疗效。我们在本研究中纳入了31名患者，其中4名患者未达到筛查合格标准。在接受治疗的27名患者中，有24名患者可进行研究评估，因为有3名患者在第1周期出现与潜在疾病相关的快速临床恶化。每个个体队列中登记的患者的基线特征描述如下本研究中患者的中位年龄为63岁（57-80岁）。大多数患者的东方合作肿瘤组表现状态为1（n=23），并且之前接受过3种或更多的治疗（n=19）。治疗患者的肿瘤类型如下：结直肠癌（CRC，n=12）、非小细胞肺癌（NSCLC，n=2）、卵巢癌（n=3）、软组织肉瘤（STS，n=3，肾细胞癌（RCC，n+1）、乳腺癌（n=1）、黑色素瘤（n=2，类癌（n_1）、膀胱癌（n+1）和前列腺癌（n/1）。患者在第1周期第1天开始口服300 mg VOR，并持续到第21天。给VOR喂食。HCQ给药开始于第1 d 2个周期。除非根据耐受性或疾病状态另有指示，否则这两种药物均按照方案连续21天给药。HCQ的起始剂量为400 mg，每日口服一次。HCQ剂量升级按照HCQ的最高给药剂量为800 mg（队列4）。
表1。基线时的人口统计汇总和疾病特征
| | 队列 |
|---|
| 特点 | 1 | 2 | 三 | 4 |
| 性别，n（%） |
| 雄性 | 2 (50) | 3（75） | 6 (55) | 1 (12) |
| 女性 | 2（50） | 1 (25) | 5 (45) | 7 (88) |
| 种族，n（%） |
| 白人/高加索人 | 3 (75) | 3 (67) | 5 (45) | 4 (50) |
| 西班牙裔/拉丁裔 | 1 (25) | 1 (33) | 6 (55) | 4 (50) |
| 黑色/非洲 | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
| 中位年龄，y（范围） | 66 (60–69) | 63 (57–70) | 61 (46–71) | 68 (58–80) |
| ECOG公司 |
| 0 | 0 (0) | 0 (0) | 2 (18) | 0 (0) |
| 1 | 4 (100) | 4 (100) | 8 (73) | 7 (88) |
| 2 | 0 (0) | 0 (0) | 1 (9) | 1（12） |
| 原发肿瘤类型，n（%） |
| 结肠直肠 | 1 (25) | 2 (50) | 6 (55) | 3 (38) |
| 非小细胞肺癌 | 1 (25) | 0 (0) | 0 (0) | 1（12） |
| 卵巢 | 1 (25) | 0 (0) | 1 (9) | 1（12） |
| 软组织肉瘤 | 1 (25) | 1 (25) | 1 (9) | 0 (0) |
| 肾 | 0 (0) | 1 (25) | 0 (0) | 0 (0) |
| 乳房 | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | 1 (12) |
| 黑色素瘤 | 0 (0) | 0 (0) | 1 (9) | 1 (12) |
| 类癌 | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) | 1 (12) |
| 膀胱 | 0 (0) | 0 (0) | 1 (9) | 0 (0) |
| 前列腺 | 0 (0) | 0 (0) | 1 (9) | 0 (0) |
| 先前治疗的行数，n（%） |
| 1–2 | 0 (0) | 1 (25) | 5 (45) | 2 (25) |
| 3–4 | 0 (0) | 1 (25) | 5 (45) | 4 (50) |
| ≥ 4 | 4 (100) | 2 (50) | 1 (9) | 2 (25) |
图1。HCQ和vorinostat（VOR）联合使用在一名肾细胞癌（RCC）患者中引起了显著的反应。(A类)研究给药方案。确定了每个队列的HCQ和VOR剂量。每个被评估的队列用红色字体表示。患者没有被纳入队列1、队列2，因为不需要剂量缩减。队列5的登记不是基于队列4中观察到的剂量限制性毒性（DLTs）。队列3使用的剂量（600 mg HCQ+400 mg VOR每日）被定义为最大耐受剂量（MTD）。(B类)HCQ和VOR治疗难治性RCC患者产生了持续50多个疗程的延长部分反应。显示了在基线检查和周期10和50后（分别为C10和C50）获得的MRI扫描。
在第1组（300 mg VOR和400 mg HCQ，两种药物每日口服（po qd））或第2组（400 mg VOR和400 mg HCQ），两种药物每日口服（po qd））的任何患者中均未观察到剂量限制性毒性（DLT）。在队列3中（400 mg VOR po qd和600 mg HCQ po qd），在该剂量水平下接受治疗的6名患者中，有1名出现DLT为3级贫血和疲劳。进一步增加到队列4的剂量（400 mg VOR po qd和800 mg HCQ po qd8名接受治疗的患者中有4名出现DLT。其中3名患者出现3级疲劳，另一名患者无脑转移，在第1 d 8个周期出现具有临床意义的2级癫痫发作。这些患者所经历的疲劳比单剂VOR治疗所预期的更严重，因此可能与添加HCQ有关。在剂量减少至400 mg VOR po qd和600 mg HCQ po qd.（队列3使用的剂量）后，未观察到额外的DLT。因此，400 mg VOR和600 mg HCQ被定义为该组合的MTD。随后扩大了登记范围，将MTD队列中的总共10名患者包括在内，以便进一步评估安全性和初步疗效。所有观察到的不良事件详见总的来说，与治疗相关的毒性通常为轻度至中度：观察到的1-2级毒性包括：恶心（n=11）、腹泻（n=8）、疲劳（n=6）、厌食（n=4）、体重减轻（n=5）、贫血（n=3）和肌酐升高（n=7）。3级毒性包括疲劳（n=3）、贫血（n=1）、血小板减少症（n+1）和中性粒细胞减少症（n=1）。这些发现表明，在既定的MTD中服用VOR和HCQ是安全的，并且通常耐受性良好。
表2。最常见的不良事件怀疑与伏立诺酯和/或羟氯喹啉治疗有关
| | NCI/CTCAE v3.0级 |
|---|
| 不良事件 | 我 | 二 | 三 | 四、 | 总计 |
| 纳西 | 6 (22.2%) | 5 (18.5%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 11 (40.7%) |
| 腹泻 | 7 (25.9%) | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 8 (29.6%) |
| 疲劳 | 3 (11.1%) | 3 (11.1%) | 3 (11.1%) | 0 (0%) | 9 (33.3%) |
| 体重减轻 | 1 (3.7%) | 3 (11.1%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 4（14.8%） |
| 厌食症 | 4 (14.8%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 4 (14.8%) |
| 贫血 | 0 (0%) | 4 (14.8%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 4 (14.8%) |
| 肌酐升高 | 2 (7.4%) | 2 (7.4%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 4（14.8%） |
| AST/ALT升高 | 1 (3.7%) | 1（3.7%） | 0 (0%) | 0 (0%) | 2 (7.4%) |
| 消化不良/呃逆 | 2 (7.4%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 2 (7.4%) |
| 发育不良 | 2 (7.4%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 2 (7.4%) |
| 血小板减少 | 0 (0%) | 1 (3.7%) | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 2 (7.4%) |
| 中性粒细胞减少症 | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 2 (7.4%) |
| 碱性。Phos高程 | 1 (3.7%) | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 2 (7.4%) |
| 高血压 | 0 (0%) | 2 (7.4%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 2 (7.1%) |
| 头痛 | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) |
| 口干症 | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) |
| 咳嗽 | 0 (0%) | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) |
| 皮疹 | 1（3.7%） | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) |
| 便秘 | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) |
| 癫痫 | 0 (0%) | 1 (3.7%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 1 (3.7%) |
肿瘤反应
虽然第一阶段研究的主要目的是评估安全性，但VOR和HCQ联合的初步抗肿瘤活性也根据实体瘤反应评估标准（RECIST）1.0标准进行了测定。17在基线时通过CT和/或磁共振成像评估肿瘤病变的所有潜在部位，并且只要患者在本研究中保持活跃，就每6周（2个周期）重新评估一次。队列1中，两名非小细胞肺癌和STS患者病情稳定。值得注意的是，队列2中的一名晚期（RCC）患者在之前的7行治疗中失败，获得了持续证实的部分缓解（PR），并维持了50多个疗程。说明这种反应的代表性肿瘤扫描图像显示在此外，一名患者患有STS和卵巢癌，另外两名患者患有克拉斯-队列3中治疗的突变CRC经历了持续时间≥4个周期或12周的长期稳定疾病。在第4队列中未观察到任何反应，该队列中登记的患者经历了DLT并退出研究。本研究中观察到的初步疗效为更多患者，尤其是RCC、CRC或STS患者进一步研究联合用药提供了依据。
表3。部分缓解（PR）或稳定疾病（SD）≥2个周期的患者
| 队列 | 年龄 | 肿瘤类型 | 循环 |
|---|
| 1 | 67 | 肺腺癌一 | 三 |
| 1 | 65 | 平滑肌肉瘤 | 6 |
| 1 | 60 | 科隆(拉斯重量） | 三 |
| 2 | 57 | 肾细胞癌（透明细胞）b条 | > 50 |
| 三 | 59 | 软组织多形性肉瘤 | 4 |
| 三 | 63 | 科隆(克拉斯突变）c（c） | 6 |
| 三 | 57 | 科隆(克拉斯突变） | 6 |
| 三 | 46 | 科隆(拉斯重量） | 4 |
| 三 | 59 | 前列腺 | 三 |
| 三 | 57 | 卵巢 | 4 |
| 三 | 59 | 科隆(拉斯重量） | 4 |
药代动力学（PK）
我们PK分析的主要目的是确定HCQ的添加是否显著影响VOR的PK谱。在第2周第20天采集外周血，以量化HCQ的全血浓度。正如预期的那样，HCQ的全血浓度是剂量依赖性的。还收集了外周血样本，以分析第1周期第1天给药前和给药后第1、2、4、6、8、24和48小时的VOR血清浓度，并在治疗前第2周期第20天以及给药后的第1、第2、第4、第6、第8、第24和第48小时获得。通过对本研究期间采集的HCQ前后样本进行相互比较，以及将本研究期间获得的数据与详述VOR PK特性的已发表数据进行比较，进行了密集抽样PK分析和非部分分析，以量化HCQ对VOR的PK特征的潜在影响。18所有分析患者的VOR浓度随时间的变化如表所示VOR的整体PK趋势（中峰浓度，C最大值=768µg/L HCQ前，786µg/L HCQ后；中位Vd/f=309 L HCQ前，304 L HCQ后；HCQ前AUC中值=3387µg*hr/L，HCQ后AUC中值为2410µg*hr/L；中位数t1/2=HCQ前2.06小时，HCQ后1.3小时），在HCQ前和HCQ后样本之间没有显著差异。因此，HCQ似乎不会干扰VOR的PK。
图2。添加HCQ不会显著影响VOR的药代动力学曲线。(A类)HCQ全血浓度的量化。按照《患者和方法》中的描述测定HCQ浓度。显示了接受400 mg和600 mg HCQ的患者的HCQ水平*指示P（P）< 0.05. (B类)VOR的血清浓度。根据《患者和方法》中的详细信息，对参与研究的患者血清中的VOR浓度进行量化。曲线图显示了血清VOR水平的时间依赖性（浓度与时间）。数字表示主题编号。患者编号后用（0.1）标记HCQ后浓度曲线。(C类)HCQ治疗前后收集的标本中VOR水平随时间变化的比较。HCQ前VOR浓度绘制在左侧（n=30），HCQ后VOR水平绘制在右侧（n=14）。Wilcoxon Signed Rank检验确定VOR浓度的时间依赖性不受HCQ添加的显著影响。
药效学（PD）
为了量化我们在VOR和HCQ联合临床前研究中确定的潜在生物标志物和PD终点，我们在治疗的第1天、第7天和第49天采集了患者的外周血样本。10,16在基线检查时和治疗后第49天对2名CRC患者进行了肿瘤活检。定量RT-PCR分析显示，细胞周期素依赖性激酶抑制剂1A的水平显著增加CDKN1A公司从基线检查时起，可以在所有4个治疗队列的患者的PBMC中检测到VOR的既定生物标记物.溶酶体蛋白酶的水平CTSD公司我们之前证明，它是CQ/HCQ和HCQ加VOR诱导的细胞凋亡的关键介体，仅在队列4的患者中增加（400 mg VOR po qd加800 mg HCQ po qd.）。考虑到该剂量水平高于MTD，这些发现表明PBMC标本可能不适合监测HCQ驱动的相关PD终点。相比之下，两项指标均较基线显著增加CDKN1A公司和CTSD公司从2例CRC患者（1例无突变拉斯【1号患者】和另一名突变患者克拉斯（2号患者）在VOR和HCQ的MTD治疗野生型患者拉斯2个周期后病情进展克拉斯突变在第2周期时病情稳定，4个疗程后病情进展。尽管我们通过这些分析能够获得的肿瘤数量很少，但我们的初步结果表明，在量化与自噬抑制相关的治疗相关标记物方面，肿瘤标本可能比PBMC更有价值。我们对PBMC自噬泡（AV）的分析进一步支持了这种可能性。值得注意的是，在任何时间点，从MTD队列中接受治疗的患者收集的PBMC样本中每个细胞的AV数均未受到VOR和HCQ治疗的显著影响。在第7天观察到AVs/cell的数量有一个非常温和但在统计学上不显著的增加。然而，到第49天，这种影响消失了，平均AVs/cell实际上略低于基线水平.
图3。HCQ和VOR刺激CTSD公司和CDKN1A公司以及自噬空泡的积聚。(A类)从基线水平折叠变化CTSD公司和CDKN1A公司在单个队列的PBMC标本中。在基线和C1D7采集PBMC标本。通过qRT-PCR量化基因表达，并将其归一化为GAPDH公司.*表示与基线相比发生了重大变化，P（P）< 0.05. (B类)在基线检查时和第49天对2名结直肠癌患者进行了肿瘤活检（1号患者=无突变拉斯，患者#2=突变型克拉斯). 从基线水平到CTSD公司和CDKN1A公司通过qRT-PCR定量肿瘤标本中的表达，并将其归一化为GAPDH公司.*表示与基线相比发生了重大变化，P（P）< 0.05. (C和D)治疗对自噬空泡的影响。在基线检查时和治疗后第7天和第49天从患者身上采集PBMC标本。利用透射电子显微镜观察并量化PBMC中的自噬空泡。MTD队列（队列3）中登记的患者每个细胞自噬空泡的平均数量如所示(C类). 基线检查第7天和第49天采集的一名患者样本的代表性图像如所示(D类).
基于这些初始PD分析，我们将额外的分析重点放在基线时收集的肿瘤活检标本和MTD治疗的2名结直肠癌患者第49天的活检标本上。有趣的是，苏木精和伊红染色用于显示肿瘤结构，这表明与两位患者的肿瘤基线相比，VOR+HCQ治疗后肿瘤坏死区域更普遍这表明治疗性坏死可能有助于HCQ和VOR的抗肿瘤活性。
图4。HCQ和VOR触发肿瘤内CDKN1A、CTSD和LC3-II水平的升高。治疗对肿瘤标本中HCQ和VOR关键生物标志物表达的影响。在基线检查时和治疗后第49天从2名结直肠癌患者（1号患者=未突变患者）中收集肿瘤活检拉斯，患者#2=突变型克拉斯). 免疫组织化学用于评估患者和方法中所述的CDKN1A、CTSD和LC3-II的水平。苏木精和伊红染色显示肿瘤结构。
免疫组织化学（IHC）用于量化在基线检查时和治疗后第49天收集的两名患者的肿瘤活检中MKI67（增殖）、活性（裂解）CASP3（凋亡）、CDKN1A（VOR效应生物标记物）、CTSD、SQSTM1和MAP1LC3B（HCQ效应的所有生物标记物用于量化的IHC图像是从没有显示高水平坏死细胞的肿瘤组织区域获得的，以通过数据解释将潜在并发症降至最低。与我们早期的临床前研究一致，这些分析表明，所有4种药物相关生物标记物（CDKN1A、SQSTM1、MAP1LC3B和CTSD）的水平均较基线水平显著增加，并且与治疗相关的肿瘤细胞增殖（MKI67）总体下降，凋亡（活性CASP3、，).16值得注意的是，MAP1LC3B染色在本质上似乎大部分呈点状。这些结果表明，小鼠异种移植可能是预测和表征HCQ加VOR在人类肿瘤中的PD效应的有用模型和总体而言，我们的PD结果表明，虽然PBMC样本可能足以评估VOR作用的生物标记物，但它们似乎在很大程度上无法用于监测本研究中实现的HCQ剂量下的体内自噬抑制。虽然不容易获得，但肿瘤活检似乎对评估与自噬抑制相关的PD效应更有价值。
图5。量化HCQ和VOR治疗对CDKN1A表达的影响(A类)、CTSD(B类)，MAP1LC3B(C类)、SQSTM1(D类)，MKI67型(E类)和活动CASP3(F类). *表示与基线相比发生了重大变化，P（P）< 0.05.
讨论
临床前研究表明，抑制自噬是一种新的策略，可以增强许多标准抗癌药物的活性并克服耐药性。5,6由于自噬可能通过细胞成分的再循环来促进生存，从而在治疗诱导的应激期间产生能量，因此以自噬为靶点具有广泛的临床用途也就不足为奇了。HDAC抑制剂是在多种临床前模型中诱导自噬的一类抗癌药物。我们和其他人已经证明，抑制自噬可以协同增强HDAC抑制剂的抗癌活性。8,9,15,16,19-21这些研究为自噬抑制剂HCQ联合VOR治疗晚期实体瘤的临床评价奠定了基础。在本研究中，我们选择了每天400毫克的VOR剂量，这是经常用于VOR给药。其他经临床评估的VOR时间表包括每天连续给药200毫克两次，每周连续给药3天，每天两次300毫克，如果作为单一药物使用。22
我们确定了600 mg HCQ po qd和400 mg VOR po qd作为MTD，并推荐了该组合的II期剂量。剂量限制性疲劳和胃肠道副作用是本研究中最常见的不良事件。当HCQ与替莫唑胺联合使用时，也观察到类似的胃肠道AE（Rosenfeld等人，该问题23)，硼替佐米（Vogl等人，本期24)和temsirolimus（Rangwala等人，本期25). 然而，我们在本研究中观察到的HCQ和VOR的严重疲劳在上述其他HCQ组合的研究中没有发生。在推荐的II期剂量下未观察到明显毒性。本研究中，非小细胞肺癌、STS和CRC患者的病情稳定。此外，一名RCC患者表现出部分反应，并在50个治疗周期后继续进行研究。这是一个有希望的结果，因为该患者在之前的7行治疗后取得了进展。我们目前正在进行一项扩展研究，以进一步评估这种联合疗法在其他肾细胞癌和大肠癌患者中的安全性和疗效。
本研究治疗了12例难治性CRC患者，其中2例病情稳定。有趣的是，这两名患者都患有激活突变的肿瘤克拉斯。鉴于先前临床前研究中已报道拉斯产生更高水平的基础自噬。26根据这些发现，有人认为拉斯突变可能对自噬“上瘾”，因此可能对自吞噬抑制过敏。在我们正在进行的扩展研究中，更多患者的加入将使我们能够进一步调查这种可能性。
进行PK分析以评估HCQ对VOR血清浓度的潜在影响。正如预期的那样，在HCQ治疗前和治疗后的患者之间，VOR的PK参数没有观察到显著差异。考虑到本研究中HCQ和VOR之间没有明显的药物-药物相互作用，我们得出结论，我们观察到的这种组合的3级疲劳率增加可能是由于HCQ的添加，而不是VOR暴露的增加。
接下来，我们评估了HCQ加VOR治疗对PD标记物的影响，我们之前在专注于该组合的临床前研究中观察到PD标记物显著诱导。诱导CDKN1A公司通常用作HDAC抑制的标志物，并且在暴露于VOR加HCQ后的临床前模型中被显著诱导。此外，在我们的临床前研究中，溶酶体蛋白酶CTSD的诱导也被确定为HCQ和VOR以及HCQ触发的凋亡的关键下游调节因子。15,16我们使用qRT-PCR在PBMC和肿瘤活检样本中测量了这两个因子的表达，这些样本是在基线检查时和VOR加HCQ治疗后采集的。与先前的临床前研究结果一致CDKN1A公司在所有4个治疗队列的PBMC标本和肿瘤活检标本中观察到HCQ加VOR治疗后的情况。CTSD公司在队列4中，PBMC中的水平仅在治疗后升高，已确定高于MTD，不建议进一步评估。值得注意的是，与PBMC相比，肿瘤活检中这两个基因的显著治疗相关诱导更为显著。与这一发现一致，我们没有观察到VOR 400 mg po qd加HCQ 600 mg po q d治疗后PBMC的AVs显著增加。这与使用替莫唑胺、全脑放疗和HCQ治疗的胶质瘤患者PBMC中观察到的AV适度但显著增加形成对比（Rosenfeld等人，本期23)，这表明抗癌主干可能对在基于PBMC的EM分析中引发显著信号很重要，或者VOR和HCQ研究的样本量无法检测到PBMC中与治疗相关的AV显著增加。总之，这些结果表明，PBMC可能不适合于评估与自噬抑制相关的生物标记物，未来以自噬抑制剂为基础的治疗组合的临床试验应考虑利用肿瘤标本进行PD终点的相关分析。为了进一步探讨这种可能性，我们对2例在MTD治疗的CRC患者治疗前和治疗后的配对肿瘤标本进行了IHC分析。我们的结果表明，药物治疗后肿瘤内CDKN1A、SQSTM1、CTSD和MAP1LC3B水平显著升高。有趣的是，肿瘤标本显示出显著的MAP1LC3B基础表达水平，这表明这些肿瘤可能具有组成性活性自噬。我们的发现与最近的一项研究一致，该研究报告了MAP1LC3B在各种晚期实体瘤中的高基础表达。27
目前，CQ及其类似物HCQ是唯一与临床相关的自噬抑制剂，目前正在20多项癌症治疗临床试验中进行评估。6我们的研究首次报道了抑制自噬作为增强传统抗癌药物疗效的新方法的临床安全性和初步疗效。值得注意的是，我们的研究表明，在VOR中添加HCQ具有良好的耐受性，并且可以安全地用于晚期实体瘤患者。我们的初步疗效分析也表明HCQ可能增强VOR的临床活性。我们目前正在扩大我们的研究范围，招募更多的CRC和RCC患者，以进一步评估HCQ和VOR在这些肿瘤类型中的联合应用。
虽然我们的研究表明，HCQ与VOR联合应用显示出良好的初步疗效，但仍有两个主要问题尚未解决。首先，尚不清楚可达到的HCQ剂量在抑制人类肿瘤自噬方面有多有效，以及这种程度的自噬抑制是否足以显著提高VOR和其他诱导自噬的抗癌药物的疗效。目前还不确定治疗诱导的自噬破坏程度是否与HCQ方案的临床敏感性直接相关。需要建立额外的数据解释标准化和适当的内部控制。例如，需要建立在肿瘤前和肿瘤后的主要活检中量化这些影响的最佳分析方法，以及定量确定有效与无效自噬抑制的标准。除了专注于解决上述问题的研究外，目前正在进行重大努力，以识别和开发新型、更有效的自噬抑制剂。Lucanthone和Lys05是两种新发现的自噬抑制剂，在临床前研究中，其疗效优于HCQ和CQ。21,28在未来的临床试验中，确定这些药物是否比HCQ表现出更大的疗效将是令人感兴趣的。
第二个尚未回答的重要问题与确定最有可能从自噬抑制剂治疗中获益的患者有关。在当前的研究中，我们观察到一名RCC患者出现了显著而持久的反应，其他一些患者病情稳定，但大多数入选患者并未从VOR加HCQ治疗中获得显著益处。建立与自噬抑制剂临床敏感性相关的预测性生物标志物对于优化这类癌症治疗药物的开发至关重要。初步数据表明RAS突变可能是一种候选基因，但其他因素也可能至关重要。对更多接受HCQ临床试验的患者进行的额外研究可能有助于解决这一非常重要的问题。总之，我们的研究结果表明，HCQ抑制自噬是一种新的安全策略，可以增强VOR的疗效。为了更严格地评估这种可能性，需要进行进一步的调查。我们的研究结果与我们同事的研究结果相结合（Rosenfeld等人，本期23; Vogl等人，本期24; Rangwala等人，本期25,29)提示自噬抑制是一种具有广泛应用潜力的新型抗癌策略。
患者和方法
患者人数
经组织学或细胞学证实的晚期实体瘤的成年患者尽管接受了标准治疗但仍有进展，或者没有标准治疗可供选择。其他关键纳入标准是RECIST 1.0定义的可测量或可评估疾病。17东方合作肿瘤集团绩效状况≤2；骨髓、肝脏和肾脏功能充足（即中性粒细胞绝对计数≥1000/mm三，血小板≥75000/mm三)；肌酐≤正常上限的2倍；总胆红素≤1.5 mg/dL；丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶≤机构正常值丙氨酸氨基转氨酶上限的3倍（如果患者有肝脏受累，天冬氨酰氨基转移酶可<正常值上限的5倍）。如果患者有以下一种或多种情况，则将其排除在外：先前记录的黄斑变性或糖尿病视网膜病变、未控制的脑转移、基线时QTc>500ms、临床上有明显症状的高钙血症、，或可能影响研究药物口服吸收的胃肠功能障碍。此外，还排除了患有活动性、临床意义重大和/或非控制性疾病的患者，包括患有非控制性银屑病的患者。
保护人类研究对象
所有患者在入组前提供书面知情同意书。本研究遵循《赫尔辛基宣言》、《国际良好临床实践协调指南会议》和地方法规（欧洲指令2001/20/EC和美国联邦法规标题21）的伦理原则。最初的研究方案和所有后续修订均由圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心的机构审查委员会批准。
研究设计和HCQ剂量增加
这项开放性I期单机构研究采用3+3剂量递增设计，对晚期实体瘤患者进行每日口服HCQ和每日口服伏立诺达（VOR）联合治疗。30VOR在第1天作为单一药物与食物一起服用，推荐的FDA批准剂量为400 mg，并持续每天直至第21天。口服HCQ治疗于第2天开始，第一阶段剂量为400毫克/天。此后每天继续服用这两种药物。三周治疗（21天）被定义为一个疗程。如果药物耐受性可以接受，重复周期而不中断。如果发生毒性反应，由主要研究者酌情决定是否允许休治疗假。三名患者在开始给药时接受治疗，如果一名或多名患者出现剂量限制性毒性（DLT），则剂量逐步增加至总共6名患者。在开始累积到下一剂量水平之前，要求给定队列中的所有患者完成前3周的治疗，以评估毒性。
毒性评估和最大耐受剂量的测定
目标DLT率≤33%。MTD被定义为6名患者中有2名患者产生DLT的剂量；或剂量水平低于6名患者中至少2名患者产生DLT的剂量。未发生患者剂量增加。如果患者在3周的联合治疗中完成了预期剂量80%的HCQ，则可对其队列进行评估。经历DLT的患者在至少服用一剂HCQ后，可对其队列进行评估。DLT被定义为在治疗的前6周（2个周期）内发生的以下性质的毒性：1）任何3级或以上的非血液学不良事件（AE），具有临床意义，至少可能与治疗有关，但恶心和呕吐除外，未经最佳止吐治疗的；2） 如果在前2个治疗周期内发生以下任何一种情况，则为血液毒性：a）持续7天以上的4级中性粒细胞减少症，B）发热性中性粒细胞缺乏症（3级或4级）和C）血小板计数（4级）低于25000/mm三。任何≥3级且可能、可能或肯定与HCQ和/或Vorinostat有关的AE将导致剂量保持不变，直到AE解决为≤1级或基线。如果不良事件得到解决，则可以按照方案规定的减少量进行恢复治疗(表S1).
安全性和疗效评估
根据CTCAE 3.0版指南评估安全性。31评估包括定期实验室评估、体检、生命体征、体重和定期心电图记录。从第一次给药到最后一次给药后28天，对所有患者进行安全性监测。其他监测包括基线眼科评估，如果患者在研究期间出现任何视觉障碍，则重复进行该评估。在基线检查时和每6周（2个周期）通过CT和/或磁共振成像评估肿瘤病灶的所有潜在部位。根据RECIST 1.0测定抗肿瘤活性。17
化学品和试剂
溶剂和甲酸为LC-MS级，购自Fluka Analytical（LC-MS CHROMASOLV®, 34688). 用于标准曲线和质量控制样品的人血清和抗凝（肝素锂）全血（单个男性供体）购自生物专业公司（115-00）。HCQ、VOR、VOR葡萄糖醛酸苷、4-苯胺基-4-氧代丁酸、氘标记（d5）VOR和VOR葡萄糖醛酸的内部标准物以及氘标记的（d4）羟基氯喹购自多伦多研究化学品公司（H916900、S688700、S688710和A663950）。4-苯胺基-4-氧代丁酸的氘标记（d5）内标由默克研究实验室慷慨提供。
HCQ全血浓度的测定
在第2个周期第20天给药之前，在肝素化管中收集用于HCQ分析的全血样本，然后转移到冷冻管中并在−70°C下冷冻。为了进行分析，将样品在冰上解冻，将100µL的等分样品与10µL内标（IS）（d4-HCQ）混合，用400µL 90:10的乙腈/甲醇剧烈旋转5分钟，然后在4°C、14000×g下离心15分钟。提取350µL等分上清液部分，并在氮气下干燥。用100µL流动相（90:10:0.1%乙腈/水/甲酸）重新配制样品，转移到冷却自动取样器（安捷伦科技，加州圣克拉拉）上的自动采样器小瓶中（4°C），并将每个样品的10µL注入LC-MS/MS系统。1200系列安捷伦HPLC系统（安捷伦科技，加州圣克拉拉）与API 4000™质谱仪（AB SCIEX，Concord，ON，Canada）一起使用，电喷雾接口以正模式操作，并进行多反应监测检测。样品通过SecurityGuard（Phenomenex，008-4462-an）注入Kinetex 50 mm×3.0 mm，2.6 um C18 100A HPLC柱中并用0.1%甲酸梯度流动相在乙腈和水中以500 uL/min的速度洗脱。使用恒温柱室将柱保持在40°C。毛细管电压为4000 V，源温度为500°C。调整质谱仪参数以使[M+H]的强度最大化+四极分子1中的离子和米/zHCQ（337.275）的过渡离子→ 248.152）和IS（341.150→ 252.035），四极柱3。HPLC系统和质谱仪由AB SCIEX分析员控制®软件（版本1.6.1）和数据收集和分析都是使用相同的软件进行的。通过绘制分析物与IS的比值与每个样品中HCQ（x）的已知浓度来构建标准曲线。通过线性回归拟合标准曲线，加权1/x。一式两份测定样品；对百分比差异超过15%的样品进行重新分析，对浓度超过校准曲线范围值的样品进行适当稀释并重新分析。校准曲线在1至5000 ng/mL范围内呈线性，相关系数在0.9990至0.9999之间。定量下限为1.0 ng/mL。对于所研究的每个浓度（15 ng/mL、750 ng/mL和1500 ng/mL），日内和日内变化的相关系数均小于5.6%。日间和日间评估的平均准确率在97.2%和102%之间。
VOR血清浓度的测定
在第1周期第1天给药前和给药后第1、2、4、6、8、24和48天采集外周血样，在治疗前第2周期第20天以及给药后第一、二、四、六、八、24和48h采集外周血样本。血液样本在室温下凝固约30分钟，然后在4°C下以2000×g离心15分钟。将所得血清转移到冷冻瓶中，并在−70°C下冷冻。为了进行分析，样品在冰上解冻，并使用Phree磷脂去除板（Phenomenex，8B-S133-TAK）进行蛋白质沉淀和过滤。用移液管吸取200µL等分血清，并将其混合到含有800µL 99:1乙腈/甲酸和10µL氘化内标混合物的微孔中，以获得5 ng/mL d5-VOR的最终浓度。将板涡旋2分钟，放置在96个样品歧管上，并在5mmHg下真空5分钟以收集滤液。使用Biotage SPE Dry 96蒸发器在37°C氮气下干燥滤液收集物。用100µL流动相（80:20:0.1%乙腈/水/甲酸）重新配制样品，转移到冷却的自动取样器（4°C）上的自动采样器小瓶中，并按照HCQ所述将10µL注入LC-MS/MS系统。使用改进的先前描述的方法进行LC-MS/MS分析。18调整质谱仪参数以使[M+H]的强度最大化+四极分子1中的离子和米/z伏立诺达的过渡离子（265.224→ 232.100）和d5-vorinostat（270.191→ 237.000），四极柱3。通过绘制分析物与IS的比值与每个样品中伏立诺酯（x）的已知浓度来构建标准曲线。通过线性回归拟合标准曲线，按1/x加权。样品分析一式两份；对百分比差异超过15%的样品进行重新分析，对浓度超过校准曲线范围值的样品进行适当稀释并重新分析。所有分析物的校准曲线在3至1000 ng/mL范围内呈线性，伏立诺司他的相关系数为0.997。每个分析物的定量下限为3.0 ng/mL。
药代动力学分析
使用Phoenix™WinNonlin 6.3进行非部门分析，拟合每个患者的VOR浓度与时间数据。通过目视检查数据确定峰值浓度和峰值时间。通过对浓度-时间曲线的末端对数线性部分进行线性回归分析，确定末端消除速率常数（λz）。使用线性对数梯形规则，计算每个分析物从时间零点到最后一次测量浓度的观察血浆浓度-时间曲线（AUC）下的总面积和一阶矩曲线值下的面积。通过将上次测量的浓度除以λz，将AUC值从上次观察的时间点外推至无穷大。平均停留时间是根据AUMC/AUC计算的，其中AUMC代表一阶矩曲线值下的面积。通过评估剂量/AUC计算VOR表观口腔清除率。VOR表观稳态分布体积由表观口腔清除率和平均停留时间的乘积确定。比较VOR单独用药和与HCQ联合用药的VOR药代动力学参数。计算每名患者的VOR AUC值比率，并比较单独服用VOR和与HCQ联合服用的VOR。
定量RT-PCR分析
使用RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen Inc.，74104）从外周血单个核细胞或肿瘤细胞中分离出总RNA。RNA用TURBO DNA-free™试剂盒（Ambion Inc.，AM1907）处理。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，4368813）进行第一链cDNA合成。CTSD公司和CDKN1A公司使用TaqMan扩增转录本®如前所述的基因表达分析。21用2计算每个基因的相对表达-ΔΔCt方法使用GAPDH公司作为家政基因。32
免疫组织化学
本研究收集了2名患者治疗前后的肿瘤活检结果。肿瘤活检用福尔马林固定，随后用石蜡包埋。石蜡包埋的肿瘤切片在二甲苯中脱蜡，暴露于分级系列酒精中，并在PBS（pH 7.5）中重新水化。在柠檬酸盐缓冲液中微波载玻片5分钟，进行热诱导表位检索。使用3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物。随后，将载玻片在PBS（Corning Cellgro，21-031-CV）中的蛋白质阻断溶液（5%马血清和1%山羊血清（Gibco，16050和16210）中孵育20分钟。将载玻片暴露于MAP1LC3B（Abcam，AB48394）、CDKN1A（Cell Signaling Technologies，2947）、SQSTM1（Abcam，AB91526）、MKI67（Cell Signaling Technologies，9027），如前所述，活性CASP3（Cell Signaling Technologies，9661）和CTSD（Abcam，AB91526）抗体在4°C的蛋白块溶液中稀释过夜。16用PBS清洗后，在室温下将载玻片在适当的二级抗体（Jackson Immunoresearch，111-035-003）中培养1小时。将载玻片与3,3′-二氨基联苯胺（Dako，S1967）孵育10分钟，以观察阳性反应。用水冲洗载玻片，然后用吉尔苏木精溶液（Sigma，GHS1128）短暂复染。使用配备DP71相机的奥林巴斯荧光显微镜在20倍放大的条件下拍摄图像（奥林巴斯，宾夕法尼亚州中央山谷）。图像采集使用MediaCybernetics Image-Pro Plus软件6.2.1版。ImageJ软件用于通过5个随机场的密度分析定量CDKN1A、CTSD和LC3-II水平，MKI67和活性CASP3阳性细胞通过前面描述的5个随机域的手动计数定量。33
自噬空泡的定量
在外周血单个核细胞（PBMC）和连续肿瘤活检中评估自噬囊泡积累作为自噬流量替代物的测量。在2个BD Vacutainer中采集静脉血样®CPT试管在以下时间点：1）周期1 d 1次预给药；2） 周期1d7次/剂量（联合治疗6d）；周期1d49（联合治疗48d）。按照制造商的指示收集2个细胞颗粒中的PBMC。从PBMC颗粒1中获得的细胞立即用2%戊二醛固定，并在4°C下保存至包埋。如前所述执行嵌入和图像捕获。34为了使用电子显微镜（日本东京JEOL-1010透射电子显微镜）定量PBMC中的AV，获得了每个样品中多个不同低倍视野中20至25个单核细胞的高倍显微照片（10000–12000×）。自噬空泡由2名独立研究人员进行评分，他们被掩盖到治疗时间点。AV的形态学标准包括：1）圆形，2）与白色或比细胞质轻的结构形成对比，3）有内含物的液泡，4）大小大于200nm的液泡和5）质膜内部的液泡大于200nm。排除了横截面上具有线粒体嵴特征的水泡结构。2名研究人员计数的平均值表示为平均值±标准误差。
统计分析
采用Wilcoxon符号秩检验评估HCQ治疗前后伏立诺达血清浓度的潜在差异。使用学生分析所有药效学数据集（基线与治疗后）t吨在GraphPad Prism版本6的帮助下进行测试。参数之间的差异在P（P）< 0.05.
致谢
这项研究得到了美国国立卫生研究院R21CA139476（FG）和P30CA054174（TC）的资助。作者感谢默克公司提供伏立诺司他支持这项研究。
术语表
缩写：
| 不良事件 | 不良事件 |
| AUC公司 | 观察到的血浆浓度-时间曲线下的面积 |
| 成人影片 | 自噬泡 |
| CQ公司 | 氯喹 |
| CRC公司 | 结直肠癌 |
| 分布式账本技术 | 剂量限制毒性 |
| HCQ公司 | 羟基氯喹 |
| HDAC公司 | 组蛋白脱乙酰酶 |
| 国际控股公司 | 免疫组织化学 |
| MTD公司 | 最大耐受剂量 |
| 非小细胞肺癌 | 非小细胞肺癌 |
| 中国人民银行 | 外周血单个核细胞 |
| PD公司 | 药效学 |
| PK（主键） | 药代动力学 |
| 人事军官 | 口头 |
| 公共关系 | 部分响应 |
| QD公司 | 每日的 |
| 碾压混凝土 | 肾细胞癌 |
| 纠正 | 实体瘤的疗效评价标准 |
| 逆转录聚合酶链反应 | 实时聚合酶链反应 |
| STS公司 | 软组织肉瘤 |
| 甚高频全向信标 | 伏里诺塔 |
工具书类
1Rubinsztein DC、Codogno P、Levine B.自噬调节作为多种疾病的潜在治疗靶点。Nat Rev药物发现。2012年；11:709–30. doi:10.1038/nrd3802。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2Yang Z，Klinsky DJ。哺乳动物自噬：核心分子机制和信号调节。当前操作细胞生物学。2010;22:124–31. doi:10.1016/j.ceb.2009.11.014。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。怀特E.解开癌症中自噬的上下文依赖性作用。Nat Rev癌症。2012年；12:401–10. doi:10.1038/nrc3262。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Janku F、McConkey DJ、Hong DS、Kurzrock R.自噬作为抗癌治疗的靶点。Nat Rev临床肿瘤学。2011;8:528–39. doi:10.1038/nrclinonc.2011.71。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Amaravadi RK、Lippincott-Schwartz J、Yin XM、Weiss WA、Takebe N、Timmer W、DiPaola RS、Lotze MT、White E.癌症治疗中自噬靶向性原则和当前策略。临床癌症研究。2011;17:654–66. doi:10.1158/1078-0432.CCR-10-2634。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Carew JS、Kelly KR、Nawrocki ST。自噬作为癌症治疗的靶点：新进展。癌症管理研究。2012年；4:357–65. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Carew JS，Nawrocki ST，克利夫兰JL。调节自噬以获得治疗益处。自噬。2007;三:464–7.[公共医学][谷歌学者] 8Carew JS，Giles FJ，Nawrocki ST。组蛋白脱乙酰酶抑制剂：细胞死亡机制和联合癌症治疗的前景。癌症快报。2008;269：7–17.doi:10.1016/j.canlet.2008.03.037。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9邵毅，高Z，马克斯·帕，江霞。组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导的凋亡和自噬细胞死亡。美国国家科学院院刊。2004;101:18030–5. doi:10.1073/pnas.0408345102。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Carew JS、Nawrocki ST、Giles FJ、Cleveland JL。靶向自噬：一种新的抗癌策略，对伊马替尼耐药性具有治疗意义。生物制品。2008;2:201–4. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Spiegel S，Milstien S，Grant S.癌症治疗中组蛋白脱乙酰酶的内源性调节剂和药理学抑制剂。致癌物。2012年；31:537–51. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Lane AA，Chabner BA。组蛋白脱乙酰酶抑制剂在癌症治疗中的应用。临床肿瘤杂志。2009年；27:5459–68. doi:10.1200/JCO.2009.22.1291。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Robey RW、Chakraborty AR、Basseville A、Luchenko V、Bahr J、Zhan Z、Bates SE。组蛋白脱乙酰酶抑制剂：耐药的新机制。分子药剂学。2011;8:2021–31. doi:10.1021/mp200329f。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Lee JH，Choy ML，Marks PA。组蛋白脱乙酰酶抑制剂的耐药机制。高级癌症研究。2012年；116：39–86。doi:10.1016/B978-0-12-394387-3.00002-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Carew JS、Nawrocki ST、Kahue CN、Zhang H、Yang C、Chung L、Houghton JA、Huang P、Giles FJ、Cleveland JL。靶向自噬增强组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA的抗癌活性，以克服Bcr-Abl介导的耐药性。鲜血。2007;110:313–22. doi:10.1182/bloud-2006-10-050260。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Carew JS、Medina EC、Esquivel JA、2nd、Mahalingam D、Swords R、Kelly K、Zhang H、Huang P、Mita AC、Mita MM等。自噬抑制通过泛素化蛋白积累增强vorinostat诱导的凋亡。细胞分子医学杂志。2010;14:2448–59. doi:10.1111/j.1582-4934.2009.00832.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Therasse P、Arbuck SG、Eisenhauer EA、Wanders J、Kaplan RS、Rubinstein L、Verweij J、Van Glabbeke M、Van Oosterom AT、Christian MC等。评估实体肿瘤治疗反应的新指南。欧洲癌症研究与治疗组织、美国国家癌症研究所、加拿大国家癌症研究院。美国国家癌症研究所杂志。2000;92:205–16. doi:10.1093/jnci/92.3205。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Parise RA、Holleran JL、Beumer JH、Ramalingam S、Egorin MJ。一种液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析法，用于定量组蛋白去乙酰化酶抑制剂vorinostat（suberoylanilide hydroxamicacid，SAHA）及其在人类血清中的代谢物。色谱B分析技术生物生命科学杂志。2006;840:108–15. doi:10.1016/j.jchromb2006.04.044。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Torgersen ML，Engedal N，Bøe SO，Hokland P，Simonsen A.靶向自噬增强组蛋白脱乙酰酶抑制剂在t（8；21）AML细胞中的凋亡作用。鲜血。2013年；122:2467–76. doi:10.1182/bloud-2013-05-500629。[公共医学][交叉参考][谷歌学者] 20Rao R、Balusu R、Fiskus W、Mudunuru U、Venkannagari S、Chauhan L、Smith JE、Hembruff SL、Ha K、Atadja P等。泛甾酮脱乙酰酶抑制剂和自噬抑制剂联合使用对三阴性人类乳腺癌细胞具有卓越的疗效。摩尔癌症治疗。2012年；11:973–83. doi:10.1158/1535-7163.MCT-11-0979。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Carew JS、Espitia CM、Esquivel JA、2nd、Mahalingam D、Kelly KR、Reddy G、Giles FJ、Nawrocki ST。Lucanthone是一种新型的自噬抑制剂，可诱导组织蛋白酶D介导的凋亡。生物化学杂志。2011;286:6602–13. doi:10.1074/jbc。M110.151324。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Kelly WK、O'Connor OA、Krug LM、Chiao JH、Heaney M、Curley T、MacGregore-Cortelli B、Tong W、Secrist JP、Schwartz L等。晚期癌症患者口腔组蛋白脱乙酰酶抑制剂亚苄基苯胺羟肟酸的一期研究。临床肿瘤杂志。2005;23:3923–31. doi:10.1200/JCO.2005.14.167。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Rosenfeld MR、Ye X、Supko JG、Desideri S、Grossman SA、Brem S、Mikkelson T、Wang D、Chang YC、Hu J等。羟基氯喹联合放射治疗和替莫唑胺联合辅助治疗新诊断多形性胶质母细胞瘤患者的一/二期试验。自噬。2014;10:1359–68. doi:10.4161/auto.28984。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Vogl DT、Stadtmauer EA、Tan KS、Heitjan DF、Davis LE、Pontiggia L、Rangwala R、Piao S、Chang YC、Scott EC等。自噬和蛋白酶体联合抑制：羟基氯喹和硼替佐米治疗复发/难治性骨髓瘤患者的1期试验。自噬。2014;10:1380–90. doi:10.4161/auto.29264。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Rangwala R、Chang YC、Hu J、Algazy KM、Evans TL、Fecher LA、Schuchter LM、Torigian DA、Panosian JT、Troxel AB等。MTOR和自噬抑制联合应用：羟基氯喹和替米罗莫司治疗晚期实体瘤和黑色素瘤患者的一期试验。自噬。2014;10:1391–402. doi:10.4161/auto.29119。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Guo JY、Chen HY、Mathew R、Fan J、Strohecker AM、Karsli-Uzunbas G、Kamphorst JJ、Chen G、Lemons JM、Karantza V等。活化Ras需要自噬来维持氧化代谢和肿瘤发生。基因发育。2011;25:460–70. doi:10.10101/gad.2016311。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Lazova R、Camp RL、Klump V、Siddiqui SF、Amaravadi RK、Pawelek JM。点状LC3B表达是实体瘤的常见特征，与增殖、转移和不良预后相关。临床癌症研究。2012年；18:370–9. doi:10.1158/1078-0432.CCR-11-1282。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28McAfee Q、Zhang Z、Samanta A、Levi SM、Ma XH、Piao S、Lynch JP、Uehara T、Sepulveda AR、Davis LE等。自噬抑制剂Lys05具有单药抗肿瘤活性，并再现了遗传自噬缺陷的表型。美国国家科学院院刊。2012年；109:8253–8. doi:10.1073/pnas.1118193109。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Rangwala R、Leone R、Chang YC、Fecher LA、Schuchter LM、Kramer A、Tan KS、Heitjan DF、Rodgers G、Gallagher M等。羟基氯喹与剂量密集的替莫唑胺用于晚期实体瘤和黑色素瘤患者的一期试验。自噬。2014;10：1369–79。doi:10.4161/auto.29118。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 30林毅（Lin Y）、施伟杰（Shih WJ）。基于传统算法的I期癌症临床试验设计的统计特性。生物统计学。2001;2:203–15. doi:10.1093/biostatistics/2.2.203。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Trotti A、Colevas AD、Setser A、Rusch V、Jaques D、Budach V、Langer C、Murphy B、Cumberlin R、Coleman CN等。CTCAE v3.0：癌症治疗不良反应综合分级系统的开发。塞明放射癌。2003;13:176–81. doi:10.1016/S1053-4296（03）00031-6。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Pfaffl MW。实时RT-PCR相对定量的新数学模型。核酸研究。2001;29：e45.doi:10.1093/nar/29.9.e45。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Carew JS、Nawrocki ST、Reddy VK、Bush D、Rehg JE、Goodwin A、Houghton JA、Casero RA Jr.、Marton LJ、Cleveland JL。新型多胺类似物CGC-11093增强硼替佐米的抗脊髓瘤活性。癌症研究。2008;68:4783–90. doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-6483。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 34Amaravadi RK、Yu D、Lum JJ、Bui T、Christophorou MA、Evan GI、Thomas-Tikhonenko A、Thompson CB。在Myc诱导的淋巴瘤模型中，自噬抑制增强治疗诱导的凋亡。临床投资杂志。2007;117:326–36. doi:10.1172/JCI28833。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
