公共科学图书馆一号。2017; 12（8）：e0183022。
从肝脏纯化的脂滴中膜微域蛋白的觅食依赖性募集
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Priyanka Rai公司
印度孟买塔塔基础研究所生物科学系
伊万·纳比，编辑器
印度孟买塔塔基础研究所生物科学系
加拿大不列颠哥伦比亚大学
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
2017年3月6日收到；2017年7月30日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可协议它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。 摘要
脂滴（LD）是中性脂肪的细胞储存，可促进脂质和蛋白质的运输，以响应代谢信号。与其他囊泡不同，LD上的磷脂膜是单层的。有趣的是，这种单层膜含有游离胆固醇，因此可能含有脂质微结构域，作为组装信号转导、细胞极性、病原体进入等蛋白质的平台。为了支持这一点，细胞培养研究检测到LD上的微结构域相关“亲筏”蛋白质。然而，这一观察的生理意义尚不清楚。在这里，我们表明，与膜微域结合的两种蛋白质（Flotillin-1和SNAP23）与从大鼠肝脏纯化的LDs的关联不同，这取决于动物的进食/禁食状态。在喂食状态下，Flotillin-1在乳酸脱氢酶上增加，可能是因为乳酸脱氢酶与内质网（ER）相互作用，促进了从内质网向乳酸脱氢酶的供应。有趣的是，flotillin-1的增加与喂食状态下LDs中游离胆固醇的增加相关。与flotillin-1相反，SNAP23在禁食状态下增加LD，这似乎介导了LD与线粒体的相互作用。这种LD-mitochondria相互作用可能为线粒体提供脂肪酸，以促进肝细胞对禁食的反应中的β-氧化。我们的工作揭示了脂滴生物学的生理相关方面，这些方面不同于细胞培养中的复制和研究，并且可能不完全可能。
介绍
脂滴（LD）是原核和真核细胞中常见的脂肪储存细胞器。LD有一个含有甘油三酯（TG）和酯化胆固醇的疏水核心，由磷脂单层包围，其中嵌入了多种蛋白质[1]. 这些细胞器主要参与调节中性脂质的储存和释放，然而蛋白质的吸收和转运也是LD的众所周知的功能[2,三]. LDs分子组成的改变可引发LD膜的显著重塑[4]这与几种代谢疾病有关[5]. 有趣的是，LDs上的单层磷脂膜还含有游离胆固醇（FC），这是一种有助于在质膜中形成膜微结构域的分子[1,6]. 这些微域被怀疑是参与信号转导、细胞极性、病原体进入等蛋白质组装的平台[7].
脂质微结构域通过其与相邻膜的紧密性而分离[8]可能是平面的（脂筏）或内陷的（小窝）。LDs上发现了与脂质微结构域相关的“拉菲”蛋白[9——11]. 而LD上caveolae的存在性则被大量讨论[12,13]，尚未解决LD上出现平面筏的问题。人工单层膜上的拉曼成像检测脂筏[14]因此，LD上可能存在筏。支持这种可能性的是，一种棕榈糖基化的蛋白ELMOD2可以与LDs结合[15]. 由于帕米酰化有利于蛋白质与富含胆固醇的微结构域结合[8]，ELMOD2可能与LD膜上的微结构域结合。LD膜上检测到胆固醇结合蛋白flotillin-1，进一步支持了LD上微结构域的存在[16]. Flotillin-1属于脂筏结合蛋白SPFH家族[17]. 由于其在信号转导、胆固醇稳态、细胞粘附、T细胞受体信号传递和与网格蛋白无关的内吞作用中的作用，Flotillins引起了人们极大的兴趣[18]. Flotillin动态定位于亚细胞隔室，信号分子可以诱导其从质膜（PM）重新分布到内体[19]. 细胞培养研究表明，flotillin-1定位于LD膜，以响应油酸（OA）处理。LDs与PM融合可导致LDs中flotillin-1的胞吐[10,20]. LDs也参与了许多与flotilin-1相关的途径，例如胰岛素信号传导和胆固醇转运[21,22]. 另一种微域相关蛋白SNAP23也作为SNARE复合体的一部分存在于LD膜上[23,24]. SNAP23促进LDs和线粒体之间的短暂融合事件，可能促进脂肪酸转移到线粒体以进行β氧化[25].
虽然上述报告提出了LDs上微域相关蛋白的有趣的可能功能，但所有这些报告都使用培养细胞。LDs上微域相关蛋白出现的生理相关性尚不清楚。为了解决这个问题，我们研究了flotillin-1和SNAP23与在动物喂食和禁食状态下从大鼠肝脏纯化的LDs的相关性。禁食强调了肝脏作为代谢恒温器的作用，可以保护身体免受脂质诱导的疾病的影响。在禁食期间，其他组织（主要是脂肪）开始快速分解TG，从而增加循环中的游离脂肪酸（FFA）。FFA被输送到肝脏，在肝细胞LDs中以TG的形式储存，然后以脂蛋白（VLDL）颗粒的形式释放TG进入循环[26,27]. 肝脏的这些功能，即储存和控制TG的释放，可以缓冲其他器官对抗循环FFA的脂毒性作用。在喂食/禁食过渡期，特定蛋白质如何被招募到LD中，这对动物体内的脂质/蛋白质流动具有重要意义。
我们发现，与禁食相比，喂食大鼠肝脏中的flotillin-1与LDs的相关性更高，并且对LDs中的游离胆固醇（FC）水平也进行了类似的观察。富含ER的微粒体上的flotillin-1水平显示出相反的趋势，这表明flotillin-1在喂食状态下从ER贩运到LDs，但这种贩运在禁食时受到抑制。有趣的是，SNAP23在LD中的招募表现出与flotillin-1相反的行为，在禁食状态下，更多的SNAP23招募到LD。线粒体标记蛋白也存在这种趋势，这表明SNAP23工程师增加了LD-mitochondria的相互作用。这种相互作用可能为线粒体提供禁食状态下肝细胞β-氧化所需的FA。为了支持这一点，细胞培养模型中广泛报道了LD-mitochondria在饥饿反应中的相互作用[25,28,29].
结果
喂食和禁食大鼠肝脏脂滴的纯化
由于禁食，身体从葡萄糖转换为TG利用。脂肪储备释放的脂肪酸到达肝脏，转化为甘油三酯，并在肝细胞中重新储存为LD。这会在禁食的肝脏中大量累积LD[30——32]. 免疫组织化学（IHC）分析证实了这种增加()使用抗紫苏素-2（LD标记蛋白）抗体对大鼠肝脏切片进行检测。喂食和禁食大鼠肝组织的薄层色谱（TLC）也显示禁食后TG显著增加(). 这种增加是3.4±0.4倍（平均值±sem；测试了3对动物），与其他报告一致[32].
在禁食状态下，Flotillin-1与从肝脏纯化的LD的结合减少。（A） 在喂食和禁食大鼠的肝组织切片上使用抗紫苏素-2抗体对LDs进行免疫染色。禁食16小时后，LD的数量急剧增加。比例尺=10μm。（B） 在禁食16小时后，TLC显示大鼠肝裂解物中的TG水平显著升高。（C） 使用紫苏素-2抗体对纯化的NLD和FLD进行染色。在单LD水平下，NLD和FLD的紫苏素-2含量没有差异。右侧面板量化了更改。每个条件使用30个LD。误差条为SEM。（D）喂食和禁食状态下从肝脏纯化的LDs的DIC图像。还显示了2μm乳胶珠。喂食和禁食状态下，纯化LD的大小没有显著变化（见正文）。（E） 从肝脏中分离的LD部分不受PM（Na-K ATP酶用作标记物）、高尔基体（高尔基-97）、细胞溶质（微管蛋白）、ER（PDI）和线粒体（VDAC-1）的可检测污染。肝提取物作为阳性对照。LD部分富含紫苏素-2（LD标记物）。（F） 通过Western blotting在正常喂养大鼠（NLD）和禁食大鼠（FLD）肝脏分离的LDs上检测到Flotillin-1。禁食后LDs的Flotillin-1水平降低。从这些样品中相同的紫苏素-2水平（通过Western blotting）和相同的TG水平（通过TLC）证实NLD和FLD的负载量相等。右侧面板量化了更改。误差条为SEM。分离的NLD和FLD上的Flotillin-1染色。显示了每个样本中具有可比大小的代表性LD。比例尺为2μm。右侧面板显示了沿单个NLD和FLD（各使用15个）周长测量的flotillin-1荧光强度（平均值±sem）。（H） 喂食和禁食状态下，肝组织提取物中的Flotillin-1水平没有显著变化。从三对动物中采集的样本中观察到的结果是一致的。肌动蛋白的免疫印迹显示肝提取物样品的载量相等。误差条为SEM（I）Western blotting，在离心法去除LDs前后，对禁食大鼠肝脏提取物的flotillin-1进行免疫印迹。去除LD（自旋后）后，未发现flotillin-1水平有明显降低。肌动蛋白的Western blotting显示TE样品的负载量相等。通过TLC降低TG水平证实了肝脏提取物中LDs的消耗。
我们已经描述了详细的协议（另请参见方法)密度梯度超速离心法纯化大鼠肝脏LDs[33,34]. 从正常喂养的大鼠肝脏中纯化的LDs称为N个正常
劳埃德秒
（荷兰）从禁食16小时的大鼠肝脏中纯化的LDs称为F类被抛弃的
劳埃德秒
（FLD）。在纯化的NLD和FLD上使用抗紫苏素-2抗体进行的免疫荧光成像显示，沿着圆周有较强的染色(；看见方法)这表明在纯化过程中LD膜没有明显破坏。沿着LD周长的荧光强度的量化也表明NLD和FLD之间的周脂蛋白-2的量没有显著变化(；每个条件使用30个LD）。
显示了NLD和FLD以及直径为2微米的乳胶珠的差分干涉对比度图像。我们观察到NLD和从多种动物中纯化的FLD的大小没有显著差异[NLDs直径=1.96±0.76μm（使用173个LDs）；FLDs=1.90±0.80μm（用178个LD）；P（P）= 0.47]. 因此，禁食后肝脏中有更多的LD，但单个纯化LD的大小没有改变。肝脏切片中LDs的Perilipin-2染色也表明LD大小没有明显差异(). Western blotting检测LDs纯度表明，分离的LD部分富含LD标记蛋白紫苏素-2，没有检测到细胞溶质、质膜、线粒体、ER和高尔基体污染(). 这是意料之中的，因为LD具有很高的浮力，并以蔗糖梯度浮到顶部[33,34].
在这里，我们想使用蛋白质印迹等生化分析来比较喂食/禁食状态下LD的蛋白质水平。因此，我们在开发一种方法上投入了大量精力，以确保两个LD样本（例如，一个NLD样本和一个FLD样本）的负载相等。我们没有假设先验NLD和FLD的表面蛋白质总量相同，因为禁食可能导致LD的脂质体和蛋白质组发生变化。相反，我们使用了一个基于折射LD散射光的等负荷程序（方法）。我们已广泛使用此程序来均匀加载乳胶粒吞噬体样品[35]. 这些乳胶粒吞噬体的大小（直径为几微米）和折射率与从大鼠肝脏中纯化的LDs相似（比较LDs和乳胶粒的图像). 通过在400nm（OD）处观察光密度的线性变化来检查该方法400)连续稀释纯化LD（未显示）。因此，对纯化的NLD和FLD样品进行适当稀释，以获得相同的OD400完成这一程序后，令人欣慰的是，我们发现等体积的这些样品（大概有相同数量的LD）的总TG和蛋白质的含量是相等的。因此，我们得出结论，NLD和FLD样品也可以通过总蛋白归一化。
flotillin-1与肝脏LDs的饮食依赖性相关性
Flotillin-1是一种脂筏相关标记蛋白，在几项细胞培养研究中发现于LDs上[10,16,20]. 我们询问flotillin-1与肝脏LDs的相关性是否与进食/禁食状态相关。Western blotting检测到NLD上有大量flotillin-1，但在多种制剂中FLD上flotillin1水平较低(). NLD和FLD样品中紫苏素-2和TG的含量相同()，确认在这两种情况下加载了相同的LD。为了验证在单LD水平下，禁食后flotillin-1降低，对纯化的NLD和FLD进行免疫染色()使用微腔免疫荧光分析（方法）。与Western blotting结果一致，与FLD相比，单个NLD沿LD周长的平均flotillin-1强度大约高出FLD的两倍(，右侧面板）。我们发现，由于背景染色和禁食肝脏中LD的丰度，很难对Fltilin-1进行成像，也很难量化肝脏切片中LD上Fltilin-1的变化。
接下来，我们比较了喂食和禁食大鼠肝脏组织提取物（TE）中的flotillin-1水平，发现没有显著差异(). 在禁食状态下，Fltilin-1对LD的可用性可能会受到限制，因为肝脏中的Fltilin-1总量是相同的()但禁食后LD数量增加。这可能是FLD上flotillin-1减少的微不足道的解释。为了研究这是否属实，我们从一只禁食的大鼠身上制备了肝脏提取物，并将其分成两等份。一部分被保留（预旋；样品中含有LD），另一部分被离心以去除浮力LD（后旋）。通过观察自旋后样品中较低水平的TG，证实了LDs的去除(). 这些样品的蛋白质印迹显示，与旋转前相比，旋转后样品中的flotilin-1没有明显减少(). 这表明，通过LDs离心去除的LD结合的flotillin-1在肝脏提取物中的总flotillin-1中所占比例可以忽略不计。因此，flotillin-1对LDs的可用性并不局限于禁食肝脏。气孔蛋白也有类似的推断[9]. 因此，FLD上flotillin-1的减少可能是由特定的代谢途径引起的，这些代谢途径控制着flotillin-1以禁食依赖的方式向LDs募集。
可以从ER向LD提供Flotillin-1
接下来，我们探讨了船队-1是如何被贩运到LD的。Flotillin-1与气孔蛋白和小窝蛋白具有共同的结构和膜结合特性[10,36]从ER贩运至LD[9,37]. 为了研究是否有类似的途径对浮萍有效，我们从喂食和禁食大鼠的肝脏中分离出微粒体（参见方法). 该微粒体部分富含ER标记蛋白PDI，但LD和线粒体标记低于可检测水平(；顶部面板）。仅显示了从喂食大鼠的肝脏制备的微粒体上增强ER的结果。禁食大鼠也观察到类似的ER增加（未显示）。与禁食组相比，喂食组动物肝脏微粒体中检测到的flotillin-1显著减少(). PDI的Western blot（ER标记）证实，喂食和禁食的微粒体样品中装载了等量的蛋白质。这一观察结果与LDs相反（喂食肝脏的LDs上的flotillin-1更多；)，并建议船队-1以禁食状态留在ER中，阻碍其向LD的运输。
LDs和ER富集微粒体上flotillin-1、GPAT4和游离胆固醇（FC）的进食-禁食依赖性变化。（A）上部面板从正常喂养的大鼠肝脏中分离的微粒体部分富含PDI（ER标记）。微粒体上未检测到线粒体标记物（HSP-60）和LD标记物（周苷-2）。装载等量蛋白质作为微粒体的肝组织提取物（TE）。下部面板从正常喂养的肝脏中分离出的膜部分富含质膜标记物（Na-K ATP酶）。未检测到细胞溶质或线粒体污染。（B） 与喂食状态相比，禁食状态下肝脏微粒体部分的Flotillin-1水平增加。针对PDI（ER标记物）的蛋白质印迹显示ER样品的负载相等。在三对喂食和禁食的动物上重复此实验，结果一致。误差线为SEM。（C）禁食后LDs上的GPAT4定位降低。与FLD相比，使用抗-GPAT4抗体的蛋白质印迹在NLD上显示出更高的水平。加载等量的NLD和FLD样品，根据这些样品上紫苏素-2带的等强度测定。这项实验在三对喂食和禁食的动物身上重复进行，得到了类似的结果。误差线为SEM。（D）用荧光法测量游离胆固醇（FC）。Y轴表示相对荧光单位（RFU）。使用已知量的胆固醇标准物（填充圆圈）建立校准曲线（直线）。然后测量NLD和FLD的RFU值（带星号的红色圆圈）。然后从校准曲线中读取这些样品中相应的FC量（如图所示）。该测量结果显示，NLD中的FC比FLD多出两倍。加载相等的NLD和FLD样品，这是根据TLC实验中样品中相等的TG量确定的。所有样品的副本用于分析。该实验重复两次，结果相似（使用两对动物）。（E） 评估大鼠全肝组织提取物、大鼠肝质膜和大鼠肝纯化LDs中的游离胆固醇。使用正常喂养的大鼠肝脏。注意Y轴上的对数刻度。从已知质量的肝组织中制备粗肝组织提取物样品，并使用该样品以及已知的FC稀释液作为标准进行TLC实验（未显示）。最佳匹配用于估计肝脏提取物样品中FC的总量(N个=3）。同样，制备了PM和LD，并在TLC实验中与FC标准进行了比较。然后估计整个肝脏的PM和LD的总FC（参见方法).
我们假设，在禁食状态下，由于禁食减少了内质网和乳酸脱氢酶之间的物理相互作用，所以浮子蛋白-1从内质网到乳酸脱氢酶的转运受到抑制。如果这是真的，禁食也应该抑制其他蛋白质从内质网到乳酸脱氢酶的转运。甘油-3-磷酸酰基转移酶4（GPAT4）是一种广泛研究的酶，可催化LD上TG的形成。GPAT4在这两个细胞器之间的物理接触处从ER重定位到LD。GPAT4的ER-to-LD靶向性导致LD上TG生物合成并增加LD大小[38]. GPAT4水平的比较显示，与三对动物的NLD相比，FLD持续下降(). GPAT4的减少伴随着FLD上flotillin-1的减少，这表明禁食状态下肝细胞中ER-LD相互作用可能下调。值得注意的是，GPAT4从ER向LD的转移被证明是单向的，并且一旦被招募到LD，GPAT5就不会离开LD[38]. 因此，我们将我们的数据解释为，由于补料状态下ER-LD相互作用，flotillin-1和GPAT4从ER到LD的传递增强。禁食状态下的反向（LD到ER）贩运虽然在形式上是可能的，但似乎不太可能发生。
靶向LDs的Flotillin-1与游离胆固醇水平相关
众所周知，Flotillin-1可以将游离胆固醇（FC）结合在脂质膜上，并且还参与对外界刺激的胆固醇转运[17]. 为了了解flotillin-1与LD关联的原因，我们因此比较了NLD和FLD之间的FC水平。从LD样品中提取总脂质，并使用敏感的胆固醇估算试剂盒测量FC（方法）。使用已知量的胆固醇标准物建立校准曲线。该校准曲线如所示用一条直线画出的黑色圆圈。我们观察到，与FLD相比，NLD上FC的富集是FLD的两倍(；标有红星的NLD和FLD数据）。对于两个LD样品（未显示），通过TLC确认TG含量相等（作为负载对照）。虽然我们确实观察到NLD和FLD之间FC的差异，但可以注意到，与其他细胞器相比，LD上FC的绝对量（微克）非常低（见下文）。
因为flotillin-1可以绑定FC[17]，从ER到LD的FC和船队-1的贩运可能是相互关联的。在试图解决这个问题之前，我们指出LDs的FC数量比整个肝组织和PM的FC数量少四个数量级(；另请参见方法). 因此，即使LD和这些细胞器中的一个或多个之间存在FC流量，这可能不会显著改变细胞器上的FC。事实上，禁食状态下LD的FC减少()在大鼠肝微粒体上未伴随任何可检测到的FC增加()，肝组织提取物()和大鼠肝脏质膜(). 由于PM与FC贩运和体内平衡密切相关[22]，我们还检查了大鼠肝脏富含PM的部分中的flotillin-1水平。PM标记物的富集在该组分中得到证实(；下部面板）。然而，在喂食和禁食状态之间，PM上的flotillin-1没有变化()，可能是因为LD上的flotillin-1含量很低（相对于PM）。
在富含ER的微粒体、肝组织提取物、质膜和线粒体上比较进食和禁食状态下的游离胆固醇水平。（A） TLC显示喂食和禁食大鼠肝脏微粒体中FC水平相等。ER标记PDI的western blotting证实了等负荷。统计分析显示，禁食后ER中FC水平无显著变化。误差条为SEM。（B）TLC显示喂食和禁食大鼠制备的总肝裂解物中FC水平相等。肌动蛋白的Western blotting显示肝裂解物样品的载量相等。误差条为SEM。（C）TLC显示，喂食和禁食大鼠肝脏中分离的富含PM的膜组分中FC水平相等。Flotillin-1在这些状态之间也没有变化。Na-K ATP酶（PM标记）的Western blotting证实了样品的等负荷。喂食和禁食的肝脏在颗粒物的FC或Flot-1水平上没有统计学差异。误差线为SEM。（D）为了确定线粒体部分的纯度，将等量的肝组织提取物（TE）和线粒体（Mitoch.）蛋白装入凝胶中进行western blotting。该部分富含线粒体标记蛋白HSP60。在该组分中未检测到细胞质（微管蛋白）和质膜（Na-K ATP酶）标记物。（E） 肝脏线粒体样品的TLC显示，禁食状态下的FC水平高于喂食状态。如VDAC1（线粒体标记物）的存在所证实的那样，将样品归一化为等蛋白。与馈电状态相比，在禁食状态下观察到FC显著增加。
由于LDs与线粒体相互作用并交换FA，我们还研究了喂食和禁食大鼠肝脏纯化线粒体部分中FC的变化。线粒体标记物HSP-60在线粒体部分富集，但无法检测到细胞溶质和PM标记物(). 在禁食大鼠肝脏的线粒体部分中观察到显著更多的FC(). 然而，已知线粒体上的FC数量要高得多[39]比我们在LD上检测到的微克数量多。因此，我们的研究不能推断LD与线粒体交换FC。FC很可能是在禁食状态下从其他细胞器运输到线粒体的。然而，flotillin-1的结果(和)和GPAT4()表明增强的ER-LD相互作用是导致FC和flotillin-1在fed状态下贩运给LD的原因。为了支持这种可能性，据报道胆固醇在培养的肝细胞中诱导ER-LD相互作用[40]. 内质网中FC水平受到严格调节，因为扰动可导致凋亡反应[41]这可能是为什么即使FC在ER和LD之间流动，微粒体部分中的FC也保持不变的原因。如果LD上的FC含量如此之少（微克；)喂食和禁食状态之间FC的相对变化会影响LD的细胞生物学吗？这个问题尚待全面回答，但现有文献确实表明了这种可能性[7,10,11].
与船队-1相比，SNAP23招募到LD的行为表现相反
接下来，我们询问禁食是否会导致另一个微域相关蛋白SNAP23与LDs的相关性降低。与flotillin-1相反，FLD患者的SNAP23水平显著高于NLD患者(). 喂食大鼠和禁食大鼠的肝提取物中SNAP23水平没有显著变化(). 我们早些时候排除了当禁食后乳酸脱氢酶数量增加时，1号船队对乳酸脱氢酶的可用性在禁食状态下受到限制的可能性（参见). 我们没有对SNAP23重复此测试，因为肝脏中喂食状态的LD较少，并且喂食状态下的LD可用性有限的问题没有出现。因此，喂食-禁食转换以与LD膜完全相反的方式诱导两种胆固醇结合蛋白flotillin-1和SNAP23的出现。
SNAP23与LDs、质膜和微粒体在进食-禁食过渡期的相关性。（A） 与NLD相比，NLD和FLD样品上针对SNAP23的蛋白质印迹显示FLD上的SNAP23更多。使用等量的NLD和FLD，这是通过Western blotting和TLC实验中的TG谱带强度证实的紫苏素-2谱带强度相等的结果。实验在三对喂食和禁食的动物身上重复进行。将SNAP23的相对强度归一化为周苷-2水平，用于统计分析。误差线为SEM。（B）SNAP23水平在喂食和禁食大鼠制备的肝提取物中没有显著变化。肌动蛋白被用作负荷控制。这一观察结果在从三对动物制备的样品中一致可见。误差线为SEM。（C）在喂食状态和禁食状态之间，未观察到富含PM的组分的SNAP23水平发生显著变化。对Na-K ATP酶（PM标记）进行Western blotting，以确保样品装载量相等。（D） 在喂食和禁食状态之间，微粒体组分的SNAP23水平没有显著变化。根据PDI进行的Western blotting显示两个样品的负载相等。误差条为SEM。（E）NLD和FLD样品上VDAC-1（线粒体标记）的Western blotting。VDAC-1仅在FLD上检测到。在从两对喂食和禁食动物中分离出的LD样品上重复此实验。
为了研究哪些细胞途径在禁食时将SNAP23募集到LD，我们首先对从喂食和禁食大鼠的肝脏制备的富含PM的级分和富含ER的微粒体级分进行SNAP23的蛋白质印迹。在PM上未观察到SNAP23的显著差异()或在微粒体上(). 因此，PM和ER可能不是SNAP23向FLD供电的主要来源。细胞培养研究有大量证据表明，细胞葡萄糖饥饿后，LD-mitochondria相互作用增加，这有助于线粒体中使用LD-derived TG进行β-氧化[25,28,29]. 事实上，我们可以在FLD上检测到大量线粒体膜标记物VDAC1，但在NLD上无法检测到VDAC1(). 这表明，在禁食状态下，肝脏中LD-mitochondria相互作用上调。这种相互作用可能由FLD上增加的SNAP23介导，并可能在禁食后葡萄糖水平耗尽时向线粒体提供TG/FA以进行β-氧化。动物运动训练后，肌肉细胞中LD-mitochondria的相互作用显著增强[42]. SNAP23的敲除减少了LD线粒体的结合，最终减缓了β氧化[25].
讨论
禁食后，由于脂肪组织中的脂肪酸流入肝脏，以细胞溶质LDs形式储存在肝脏中的TG大量增加[27]. 在这里，我们观察到禁食后大鼠肝脏LDs中flotillin-1的显著降低。与我们的发现相反，当培养细胞用FA处理时，LDs上的flotillin-1增加[10]. 这就引出了细胞培养模型和体内场景。Flotillin-1可以调节几种激酶的活性[17]. ERK2和PKA是已知的存在于LD上的激酶[43]，并可能成为第1舰队的目标。在喂食和禁食状态下，flotillin-1与LD的差异结合的下游后果仍有待研究。
根据我们的结果提出了一个工作模型。富ER微粒体上的Flotillin-1呈现出与LD上的flotlin-1相反的趋势，这表明该蛋白在喂食状态下从ER转移到LD。从内质网到内质网的蛋白质具有共同的拓扑特征，例如疏水基序，这允许它们插入内质网膜（3）。已知这种基序存在于flotillin-1和来自同一家族的其他蛋白质（例如气孔蛋白）上[18]. 有趣的是，气孔蛋白也从内质网招募到内质网，尽管其重要性尚不清楚[9]. 由于flotillin-1在胆固醇运输中的作用已被充分研究[44]在FLD和NLD上测量胆固醇水平。虽然LD的FC水平很低（微克），但与FLD相比，我们观察到NLD膜上的胆固醇更多。值得注意的是，其他人和我们在吞噬体上都证明了胆固醇和flotillin-1募集之间的正相关关系[35,45]. 鱼粉可能从内质网运输到乳酸脱氢酶，这可能是由于肝脏喂食状态下内质网与乳酸脱氢酶相互作用增强所致。通过在NLD上观察更多的GPAT4，支持了这种可能性(). FC在培养肝细胞LDs上的积累促进LD与ER融合[40]. 因此，喂食状态下LD上FC的增加可能会介导ER-LD相互作用，从ER向LD贩运flotillin-1和GPAT4。
肝内脂滴微结构域相关蛋白的禁食依赖性补充工作模型。联邦政府：LD上的游离胆固醇水平增加，可能介导ER-LD相互作用（粗双头箭头）。Flotillin-1从ER贩运到LD，可能是因为增强了ER-LD相互作用。因此，在喂食状态下，胆固醇结合蛋白（如flotilin-1）在LDs上增加。这些蛋白质可能存在于LD膜上胆固醇诱导的微结构域上。Fasted状态：由于脂肪组织进入肝脏的FA流量增加，肝脏中有更多的LD。然而，这些LD似乎与ER的相互作用较少。ER-LD相互作用减少的证据是GPAT4从ER向LD的转移减少（未在示意图中显示）。ER-LD相互作用的减少也可能阻碍flotillin-1向LD的转移。然而，像SNAP23这样从内质网（可能是胞浆）以外的来源提供给LD的蛋白质现在在LD膜上大量存在。LD上高水平的SNAP23增加了LD和线粒体之间的相互作用（灰色箭头），LD上存在线粒体标记蛋白证明了这一点（例如VDAC-1；示意图中未显示）。
与flotillin-1不同，FLD患者的SNAP23水平高于NLD患者。这是意料之外的，因为众所周知SNAP23可以结合胆固醇[46]FLD的FC比NLD少(). 然而，SNARE/SNAP23募集对胆固醇的要求仅针对双层膜进行了讨论[23]SNAP23向LDs单层膜募集的机制可能与胆固醇无关。早期关于SNAP23与LD关联的报告中没有讨论这个问题[24,47]. 有趣的是，线粒体标记蛋白VDAC1在禁食期间出现在LD上()表明禁食状态下肝脏中LD-mitochondria相互作用增加。有大量证据表明，葡萄糖的减少会增加LD-mitochondria的相互作用，因此FA-底物可以提供给线粒体进行β氧化[28,29]. 此外，LD与线粒体的相互作用依赖于SNAP23，SNAP23的RNAi敲除可阻止周苷-2从LD转移到线粒体，同时降低NIH3T3细胞中的β氧化[25]. 因此，FLD上SNAP23的增加可能促进LD向线粒体提供FA。flotillin-1和SNAP23都高度依赖于翻译后修饰，如结合质膜的棕榈酰化[10,23]. 喂食或禁食期间这些蛋白质翻译后修饰的差异可以调节它们与LD膜的结合亲和力。然而，这些问题仍有待解决。
总之，我们报道了在喂食/禁食周期中肝脏中两种膜微域蛋白向LDs的不同募集(). LD是动态细胞器，以代谢调节的方式与其他细胞成分交换蛋白质/脂质[三,29]. 脂质微域和微域相关蛋白作为信号转导、细胞极性、运输和病原体进入的平台，在这方面引起了人们的特别关注[17]. LD在肝脏中可能在进食和禁食状态下发挥不同的功能，其中一些功能是通过微域相关蛋白在这两种状态下向LD的不同募集而启动的。从这个意义上讲，LD似乎对代谢波动非常敏感。此处观察到的禁食诱导的LDs上flotillin-1、SNAP23和FC的变化引起了人们对LDs在代谢相关病理条件中的作用的兴趣。值得注意的是，脂肪细胞中检测到大量的游离胆固醇，这些细胞含有大量的LDs[48]. 因此，脂肪组织被认为在清除血浆中的胆固醇方面起着重要作用。由于肝脏和脂肪组织对脂质/胆固醇的体内平衡非常重要，因此了解胆固醇是如何在这些组织中转运到LD的就变得非常重要。
我们的报告主要局限于对从肝脏纯化的LDs进行终态生化分析，无法阐明肝脏中LDs的蛋白质补充动力学。然而，我们的研究确实揭示了在喂食/禁食周期中，肝脏中蛋白质向LDs转运的生理相关途径。这些途径无法被充分探索，甚至可能无法在培养细胞中繁殖，因为缺少所需的代谢信号。我们希望改进技术体内成像将有助于更好地理解这些现象及其在未来肝脏内的时空动力学。这应该是一项值得努力的工作，因为肝脏在整个进食-禁食周期中无法控制脂质流动是脂肪肝的前兆[49]. 此外，几种靶向肝脏的病毒（如丙型肝炎、登革热）与乳酸脱氢酶密切相互作用，也可能需要乳酸脱氢酶与内质网相互作用以进行病毒复制[50]. 因为质膜上的微结构域充当病原体进入细胞的“门”[51]，LDs上的微域可能在病毒复制中起作用。
材料和方法
试剂
Perilipin-2抗体（651102）购自德国Progen Biotechnik。GPAT4抗体来自Abcam（Cat.#ab 76707）。针对flotillin-1（133497）、SNAP23（3340）、Na的抗体+-K（K）+ATP酶（7671）、VDAC1（15895）和HSP60（46798）购自Abcam。PDI抗体（610946）和Golgin-97抗体（21270）分别购自BD Biosciences（加州圣何塞）和Invitrogen。肌动蛋白抗体（AANO1-A）购自Cytoskelt Inc.（科罗拉多州丹佛市）。所有其他试剂均购自印度班加罗尔Sigma-Aldrich。硅胶薄层色谱板来自默克公司。TG标准品来自Avanti Polar Lipids，Inc.（阿拉巴马州阿拉巴斯特）。
动物
所有实验均使用3-4个月大的雄性Sprague-Dawley大鼠。动物实验程序由动物实验控制和监督委员会（CPCSEA）制定的机构动物伦理委员会批准。“喂食组”的大鼠保持12小时的正常光照/12小时的黑暗循环，并以标准的实验室饮食喂养。“禁食组”的大鼠禁食16小时。这两组动物的水供应不受限制。来自同一窝的老鼠被用作一对禁食的老鼠。
LD的隔离
采用蔗糖梯度法从动物肝脏中分离LDs[33,34]. 在这个过程中，用硫喷妥钠注射液对动物进行麻醉。对麻醉动物进行解剖，并通过肝门静脉进行肝脏灌注。用约30ml的1XPBS灌注肝脏。然后将组织切成小块，并使用Dounce匀浆器在匀浆缓冲液（35mM PIPES、5mM EGTA、5mM MgSO）中匀浆4和1M蔗糖pH-7.2）。在匀浆前向缓冲液中添加蛋白酶抑制剂混合物（2x）、4mM DTT、4mM PMSF和2μg/ml胃蛋白酶抑制素，以抑制蛋白酶活性。所有步骤（包括均化）均在4°C下进行。匀浆后，通过在1800℃离心组织匀浆制备PNS（核后上清液）克在4°C下保持10分钟。收集上清液（PNS）时未扰动颗粒。然后将该肝脏PNS部分与2.5M蔗糖缓冲液混合至1.6M的最终摩尔浓度，并在SW32转子中蔗糖梯度的底部加载。该层覆盖1.4M、1.2M、0.5M和0M蔗糖，均通过在均质缓冲液中混合蔗糖制备。蔗糖梯度以110000倍的速度旋转克在4°C下保持1小时。从梯度顶部收集LD部分，并立即通过离心浓缩（14000克在4°C下保持10分钟）。这导致浮力LD在顶层堆积。接下来，在注射器的帮助下小心地取出皮下组织，并允许LD顶层漂浮在500μl小体积的同一缓冲液中。所有与western印迹相关的实验都需要LD组分的浓度程序，以最大限度地减少SDS-PAGE凝胶中LD样品的装载量。随后，使用带有宽孔尖端的吸管重新悬浮LD部分。对NLD和FLD部分同时执行该步骤，以保持程序的一致性。然后对NLD和FLD样品进行归一化处理，以获得TG量（见下一节），校准并储存在−20°C下以备进一步使用。
LD归一化和薄层色谱
调整NLD和FLD样品以获得相等的光散射值（通过400nm处的光密度测量）（OD400)用于分光光度计中的两个样品。正如TLC实验中测量的那样，还观察到此类“归一化”NLD和FLD样品具有相等的TG量。通过连续稀释LD样品并绘制OD来评估该方法的灵敏度400根据TLC获得的TG带强度。观察到线性变化（未显示）。
对于TLC，使用所述的标准程序从样品中提取脂质[52]. 萃取后，将脂质样品重新悬浮在氯仿中，并使用玻璃毛细管在硅胶TLC板（Merck）上进行斑点。二氧化硅板在氯仿中预先运行，并在点样样品之前进行空气干燥。使用两种溶剂系统来解析TG[38]. 首先，部分平板在己烷：乙醚：乙酸中以70:30:1的比例运行。然后将板从TLC室中取出并风干。第二个溶剂系统为己烷：乙醚，比例为49:1。允许该溶剂在靠近板顶部的位置流动。接下来，将板风干并喷涂10%CuSo48%H中三人事军官4。溶液蒸发后，在200°C的热风炉中烘烤15–20分钟。分别用TG和FC标准品鉴定样品中的TG和FC。在BioRad仪器的白光照明下拍摄TLC板的图像。使用ImageJ软件测量TG和FC波段的强度。
肝组织提取物（TE）制剂
灌注后，将肝脏解剖并在匀浆缓冲液中切成小块，然后在冷态下匀浆。匀浆在1000℃下离心x克2分钟，取出大块组织。离心后，将组织提取物（TE）作为上清液进行回收、校准并储存在−20°C下。为了耗尽TE中的LD，TE以500000的速度离心x克持续1小时。仔细移除LD的顶层。剩下的部分（含有颗粒和悬浮液）再次悬浮在悬浮液中，并对该样品进行蛋白质印迹处理。
微腔免疫荧光分析
此方法改编自[53]经过修改。使用附在玻璃载玻片上的盖玻片和双粘胶带制备微室。然后将LD样品（30μl）吸入微室。通过在加湿箱中培养微腔20分钟，使浮力LD漂浮并粘附在盖玻片表面（保持与盖玻片倒置）。在下一步中，将30μl封闭溶液（6%BSA在1XPBS中）通过微腔，培养30分钟。培养后，通过3x30μl 1XPBS溶液清洗微室。在封闭缓冲液中制备一级抗体溶液（30μl），并将其吸入微室。在初级抗体中孵育30分钟，然后用3x30μl 1XPBS溶液洗涤。然后吸入30μl二次抗体稀释液，并进行30分钟的培养。再次用3x30μl的1XPBS清洗，以去除任何非特异性抗体结合。立即进行成像以避免信号褪色。以1:50的稀释度使用flotillin-1的一级抗体。Alexa 555结合二级抗体以1:250的稀释度使用。
LD样品中游离胆固醇（FC）的估算
使用HDL和LDL/VLDL胆固醇测定试剂盒（Abcam ab65390）在LD样品上估计FC值。遵循推荐的FC荧光检测方案。该程序仅检测FC，因此预计不会受到胆固醇酯的干扰。在本试验中，从NLD和FLD样品中提取总脂质，然后在试剂盒中提供的试验缓冲液中进行再悬浮。从分析缓冲液中的总脂质溶液中制备稀释液和重复样品。所有LD样本的读数是重复值的平均值。
大鼠肝微粒体的分离
根据已公布的方案从肝脏中分离出富含ER的微粒体[54]. 将肝组织切成小块，在Dounce匀浆器中匀浆20次。均质缓冲液由20mM Tris-HCl、250mM蔗糖和1mM EDTA组成，pH 7.4，并预冷至4°C。然后在500℃下离心肝匀浆x克15分钟后清除细胞碎片。收集上清液并在14000再次离心x克持续10分钟使线粒体颗粒化。此步骤重复三次。然后将上清液离心至106000x克在4°C下保持1小时。去除产生的上清液，并收集微粒体作为小球。对从该步骤中回收的微粒体进行高盐洗涤，以去除外周粘附的蛋白质和LD。通过将微粒体部分重新悬浮在由0.5M KCl和10mM Tris-HCl组成的缓冲液中进行高盐洗涤（使用Dounce匀浆器进行温和匀浆）。微粒体在4°C的缓冲液中在低速摇床上培养30分钟。微粒体再次造粒至106000粒x克持续1小时。最后将微粒体颗粒重新悬浮在500μl含有10mM Tris-HCl、pH 7.5和250mM蔗糖的缓冲液中，并在-80°C下进行校准和储存。
大鼠肝脏质膜富集组分的分离
根据公布的方案从大鼠肝脏中分离出质膜（PM）部分[55]进行了一些修改。解剖大鼠肝脏，并在由20mM Tris-HCl、250mM蔗糖和1mM EDTA组成的三体积匀浆缓冲液中匀浆，pH-7.4。在本报告中，仅使用核分数（N）分离PM。核分数（N）用均质缓冲液进行两次洗涤。如原始方案中所述，PM作为N2部分从梯度中分离出来。将PM级分（N2）沉淀并用含有250mM蔗糖的10mM Tris-HCL缓冲液洗涤一次。造粒后，将PM部分重新悬浮在上述缓冲液中，并储存在-80°C下。
大鼠肝线粒体的分离
按照公布的方案从大鼠肝脏中分离线粒体部分[25].
大鼠肝提取物、质膜和LDs中FC的估算
我们的目的不是估计FC的确切水平，而是获得肝脏中FC量和LDs中FC量之间的近似相对估计值。粗肝组织提取物（TE）是从已知质量的肝组织中制备的。以该TE和已知FC稀释液作为标准品（未显示）进行TLC实验。最佳匹配用于估计样本中FC的总量(N个=使用3只大鼠）。同样，制备了PM和LD，并在TLC实验中与FC标准进行了比较。然后估算整个肝脏PM和LDs的总FC（乘以比率（整个肝脏重量/样品中使用的肝脏重量）。
蛋白质斑点
对于NLD和FLD样品的western blotting，在10%SDS-PAGE凝胶上加载等量的“归一化样品”（见上文）。在室温下，在PVDF膜（罗氏）上以45mA的电流过夜转移蛋白质。采用类似的程序对TE和ER微粒体样品进行western blotting。使用BCA试剂盒对TE和ER样品进行蛋白质估计。在PVDF膜上过夜转移蛋白质后，使用0.1%吐温-PBS中制备的5%奶粉封闭膜。在封闭溶液中制备一级抗体稀释液。与一级抗体孵育后，用0.1%吐温-PBS清洗膜三次，用过氧化物酶偶联二级抗体（1:10000 Santa Cruz Biotechnology）孵育，并用ECL试剂（WBKLS0500，Millipore）在X射线胶片上检测。
肝组织免疫组织化学（IHC）
肝脏切片的IHC是按照已公布的方案进行的[56]. 使用生理盐水对麻醉动物进行全身灌注15分钟，然后使用4%PFA，直到观察到全身抽搐和组织清除。灌注4%PFA约20分钟，然后解剖肝脏，切成3-4英寸的小块，并将其保存在4°C 1XPBS中制备的40%蔗糖溶液中约36小时，以使组织块完全沉入缓冲液中。接下来，在低温恒温器（徕卡生物系统公司）中进行组织切片。将组织块安装在OCT溶液中（Fisher Scientific），并在低温恒温器中获得10μm厚的切片。使用Superfrost幻灯片（Thermo Scientific）放置截面。各节段再次在4%PFA中固定10分钟，然后用1xPBS分别固定3节段10分钟。在与一级抗体孵育之前，对切片进行抗原提取。抗原回收缓冲液的组成为10mM柠檬酸钠，0.05%吐温20，pH 6.0。切片在98°C沸水浴中的抗原回收缓冲液中培养3-4分钟。用1XPBS清洗切片一次，然后在1XPBS中的3%BSA溶液中进行封闭1小时。然后用1XPBS清洗切片，并在室温下在一级抗体溶液中培养1小时。然后用1XPBS清洗切片三次，每次10分钟。在二级抗体溶液中在室温下孵育1小时，然后用1XPBS清洗三次，每次10分钟。抗体孵育后，用Vectashield（Vectorlabs）贴装切片，并在共焦显微镜上成像。
共焦显微镜
所有样品的成像均在带有63倍油物镜的蔡司LSM 710共焦显微镜上进行。
统计分析
除非另有说明，所有实验均使用三对大鼠（喂食和禁食）。进行统计分析以确定P（P）-t检验法得出的值（相关的单样本或双样本t检验）。
致谢
RM和PR承认来自惠康信托基金——生物技术部联盟的资助（拨款IA/S/11/2500255和IA/E/11/1/500417）。我们感谢穆凯什·库马尔和贾吉特·辛格在实验方面的帮助。提交人确认，他们没有利益冲突。我们感谢塔塔基础研究所动物房设施的服务。
资金筹措表
原子能部塔塔基础研究所和生物技术联盟部威康信托基金提供的资金（授予IA/S/11/2500255和IA/E/11/1/500417）。
工具书类
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