iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution

doi:10.1016/j.ymeth.2013.10.011

.2014年2月；65(3):274-87.

doi:10.1016/j.ymeth.2013.10.011。 Epub 2013年10月25日。

iCLIP：核苷酸分辨率下的蛋白质-RNA相互作用

伊娜·赫佩茨¹, 简·阿提格¹, 安德烈亚·达姆布罗乔¹, 劳拉·伊斯顿², 克里斯托弗·R·西伯利¹, 杉本洋一郎², 莫伊卡·塔伊尼克^三, 朱利安·科尼格⁴, 杰内·乌莱⁵

附属公司

¹伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场；英国剑桥CB2 0QH Francis Crick大道MRC分子生物学实验室。
²英国剑桥CB2 0QH Francis Crick大道MRC分子生物学实验室。
^三英国剑桥CB2 0QH弗朗西斯·克里克大道MRC分子生物学实验室；卢布尔雅那大学医学院，斯洛文尼亚卢布尔雅那1000号Vrazov trg 2。
⁴伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场；英国剑桥CB2 0QH弗朗西斯·克里克大道MRC分子生物学实验室；分子生物学研究所，Ackermannweg 4，55128 Mainz，德国。电子地址：j.koenig@imb-mainz.de。
⁵伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场；英国剑桥CB2 0QH，Francis Crick Avenue，MRC分子生物学实验室。电子地址：j.ule@ucl.ac.uk。

PMID： 24184352
PMCID公司：项目经理3988997
内政部： 10.1016/j.meth.2013.10.11

iCLIP：核苷酸分辨率下的蛋白质-RNA相互作用

伊娜·赫佩茨等。方法. 2014年2月.

.2014年2月；65(3):274-87.

doi:10.1016/j.meth.2013.10.11。 Epub 2013年10月25日。

作者

伊娜·赫佩茨¹, 简·阿提格¹, 安德烈亚·达姆布罗乔¹, 劳拉·伊斯顿², 克里斯托弗·R·西伯利¹, 杉本洋一郎², 莫伊卡·塔伊尼克^三, 朱利安·科尼格⁴, Jernej Ule公司⁵

附属公司

¹伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦皇后广场WC1N 3BG；英国剑桥CB2 0QH Francis Crick大道MRC分子生物学实验室。
²英国剑桥CB2 0QH Francis Crick大道MRC分子生物学实验室。
^三英国剑桥CB2 0QH弗朗西斯·克里克大道MRC分子生物学实验室；卢布尔雅那大学医学院，斯洛文尼亚卢布尔雅那1000号Vrazov trg 2。
⁴伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场；英国剑桥CB2 0QH弗朗西斯·克里克大道MRC分子生物学实验室；德国美因茨Ackermannweg 4，55128，分子生物学研究所。电子地址：j.koenig@imb-mainz.de。
⁵伦敦大学学院神经病学研究所分子神经科学系，英国伦敦WC1N 3BG皇后广场；英国剑桥CB2 0QH，Francis Crick Avenue，MRC分子生物学实验室。电子地址：j.ule@ucl.ac.uk。

PMID： 24184352
PMCID公司：项目经理3988997
内政部： 10.1016/j.meth.2013.10.11

摘要

RNA-结合蛋白（RBP）是基因表达转录后调控的关键参与者。因此，对其结合位点的准确了解对于揭示其分子功能以及了解其在发育和疾病中的作用至关重要。单个核苷酸解析-紫外线交联和免疫沉淀（iCLIP）在全基因组范围内鉴定蛋白质-RNA交联位点。该方法的高分辨率和特异性是通过分子内cDNA循环步骤实现的，该步骤可以分析在蛋白-RNA交联位点截短的cDNA。在这里，我们描述了改进的iCLIP协议，并讨论了将该方法应用于新RBP时所需的关键优化和控制实验。

关键词：高通量测序；认购后监管；蛋白质-RNA相互作用；RNA；RNA结合蛋白；紫外线交联免疫沉淀（CLIP）；iCLIP。

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数字

图1
iCLIP程序识别完整细胞中RNA–蛋白质相互作用的示意图。在冰上用UV-C光照射细胞，导致蛋白质和RNA之间形成共价键。随后进行部分核糖核酸酶消化，并用蛋白特异性抗体进行免疫沉淀。对于文库的制备和可视化，RNA被去磷酸化，3′端适配器被连接，5′端被放射性标记。通过SDS–PAGE分离复合物，并根据预期尺寸从硝化纤维素膜中分离。然后蛋白质被蛋白酶K消化，并在剩余的多肽上进行逆转录（RT）截短。RT引物引入了两个可切割的适配器区域和条形码序列。通过尺寸选择去除游离的RT引物，并进行cDNA的环化。线性化生成适合PCR扩增的模板。在最后一步中，高通量测序生成读取，其中条形码序列后面紧跟着cDNA的最后一个核苷酸。

图2
使用光反应核苷和超声波的测试。（A）增加4-硫代尿苷（4SU）或6-硫代鸟苷（6GU）浓度会导致HeLa细胞死亡。用4SU（4SU；25μM，100μM和500μM）或6SG（6SG；25µM，100µM）处理HeLa细胞96小时。使用台盼蓝染色法在不同时间点对活细胞进行计数，并将其归一化为初始细胞数（用对数表示₂). 使用台盼蓝在每个时间点对死亡细胞进行计数，并显示为该时间点细胞总数的百分比。（B）增加4SU或6SG浓度会抑制HEK293细胞的生长。分别用4SU（25μM、100μM和500μM）或6SG（5μM、25μM和100μM）处理HEK293细胞96或48小时。显示如（A）所示。（C） hnRNP C可以与UV-C或UV-A光结合4SU交联。放射自显影显示放射性标记的hnRNP C蛋白–RNA复合物。4SU孵育30和60分钟后，用UV-A光进行交联，并与UV-C交联进行比较。没有抗体的样本作为对照。右侧标记了非交联hnRNP C蛋白的大小。（D）用内源性TIA1或hnRNP C抗体免疫沉淀的放射性标记蛋白–RNA复合物的放射自显影。由于超声可以释放染色质相关蛋白，因此在免疫沉淀之前，样品要么经过超声处理，要么未经处理，RNA用1/50稀释的RNase I消化。没有抗体的样本作为对照。右侧标记了未交联蛋白质的大小。星号表示hnRNP C二聚体。

图3
去磷酸化和部分核糖核酸酶消化试验。（A）优化RNase I浓度对于获得最佳片段大小至关重要。放射自显影显示免疫沉淀前用降低RNase I浓度处理的hnRNP C蛋白–RNA复合物。右边的标记（A–E）表示从硝化纤维素膜上切下的五个尺寸范围。没有抗体的样本作为对照。未交联hnRNP C和hnRNP C-二聚体的大小分别用箭头和星号标记。（B）用1/250稀释度的部分核糖核酸酶消化产生回收RNA片段大小的最佳分布。通过蛋白酶K消化从hnRNP C蛋白–RNA复合物中分离的RNA组分的大小分离。从硝化纤维素膜的五个区域（A–E，见（A）中的标记）分离出三种不同处理样品的RNA（RNase I的1/50、1/250和1/500稀释液）。（C） PNK处理20min对3′端脱磷最有效。用虾碱性磷酸酶（SAP）处理PTB蛋白–RNA复合物20min或用多核苷酸激酶（PNK）处理20min或2h，比较文库制备后的cDNA产量。没有抗体的样本作为对照。

图4
文库准备和尿素处理的质量改进。（A）逆转录（RT）引物的效率可能不同。通过凝胶电泳分析hnRNP C iCLIP文库，测试不同的反转录引物。RT引物RT#clip 1、2、6、9、10和13–16被鉴定为对文库制备最有用的引物。注意，在本实验中，省略抗体的对照也在PCR凝胶上显示产物，表明纯化中存在一些杂质。对于底漆质量的评估，这没有影响。此外，与使用相同RT引物（Rt9clip）逆转录的样品相比，产物的信号弱得多。（B）碱性水解能有效去除放射性标记的RNA，并且不影响文库的制备。使用RT引物Rt1clip和Rt2clip扩增cDNA文库的凝胶图像，并提取低和中等大小范围（L，70–80 nt；M，80–100 nt）。样品经过或不经过碱水解处理。RT之前和凝胶提取之后的每秒放射性计数如上所示。（C） PCR扩增周期的增加导致二次产物的形成。hnRNP C iCLIP文库使用21到39个周期进行扩增。超过31个周期的二次产品的外观表明过度放大。为了进行比较，显示了循环编号35和39的1/10和1/100稀释。

图5
使用尿素处理的替代IP。变性尿素处理阻止了约40 kDa的第二个RBP的共同纯化。使用标准iCLIP协议（无尿素处理）纯化FLAG-tagged Staufen 1（STAU1），并与使用变性尿素处理的免疫沉淀程序进行比较。

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