一种越来越多地用于表征与特定RNA-结合蛋白相关的核糖核蛋白复合物的方法依赖于免疫或亲和纯化程序，然后识别共纯化RNA或蛋白质分子。对这些实验的解释通常基于这样的假设：在实验操作期间，体内组装的RNA-蛋白质复合物的完整性得到了保持，因此观察到的关联反映了体内的相互作用。然而，这一假设的有效性尚未通过实验进行验证。在这里，我们询问在一个细胞群中表达的RNA-结合蛋白是否可以在细胞裂解后与在不同细胞群中表现的靶RNA相关联。与一般预期相反，观察到了显著的结合水平，这表明联合免疫沉淀可能并不总是能够重现核糖核蛋白复合物的体内状态。
为了进行分析，我们重点研究了特征良好的RNA结合蛋白HuR与其靶mRNA c-fos之间的相互作用(Brennan和Steitz，2001年). 实验设计如图1A所示具体而言，将表达HuR或c-fos的质粒一起或单独转染到HEK293细胞中。转染的HuR在其C末端携带FLAG标签，以区分外源表达的蛋白质和转染细胞的内源性蛋白质。在所用条件下，HEK293细胞中无法检测到内源性c-fos mRNA，因此不会干扰分析（图1B，车道2）。所示细胞群（图1A)将提取物与抗FLAG抗体混合、溶解，并在与这些类型实验中通常使用的条件类似的条件下进行免疫沉淀(斯泰兹1989;Pinol-Roma等人，1990年;Tenenbaum等人，2002年).
A类在混合实验中检查的HEK293细胞群体的示意图。收获前24小时，用所示质粒转染细胞（使用TransIT 293转染试剂Mirus）：c-fos：含有CMV启动子控制下的c-fos基因的质粒（由Nicholas K.Conrad博士善意提供）；HuR-FLAG：在CMV启动子控制下表达FLAG-tagged HuR的质粒(Fan and Steitz 1998年); -: pcDNA3空载体（Invitrogen）。B类。中描述的单元格A类在PBS中被刮伤，并且在A类在裂解前混合。通过离心将细胞制成颗粒，并将细胞颗粒重新悬浮在含有10 mM Tris-Cl（pH 7.5）、100 mM NaCl、2.5 mM MgCl的缓冲液中20.5%的Triton®声波风廓线仪X-100，并被冰上的短暂声波干扰（2×5秒，设置2.5）。将提取物在10000 g下离心10 min，并在4℃下用单克隆M2抗FLAG抗体（Sigma）IP处理1.5 h。免疫沉淀物质在含有1%SDS和10 mM DTT的缓冲液中从珠中释放。如前所述，通过RNase保护分析输入和免疫沉淀物质的一部分(泰姆斯1995)探针杂交到人类c-fos RNA的最后一个外显子(上面的面板）。前两个通道：未消化探头（0.025%负载）和消化探头（100%负载）。用兔多克隆抗FLAG抗体（Sigma）对剩余材料进行western blot分析(中间的面板）；膜被剥离并用抗HuR的3A2单克隆抗体重新组装(Gallouzi等人，2000年)(降低面板）。
正如预期的那样，当两种成分被转染到相同的细胞中时，c-fos mRNA与HuR-FLAG共同免疫沉淀的显著水平（图1B，车道3）。值得注意的是，当RNA-结合蛋白和靶RNA在不同细胞中表达时，也观察到显著水平的协同免疫沉淀（图1B，车道4）。应该注意的是，当在与HuR-FLAG不同的细胞群体中表达时，共沉淀的c-fos RNA的量明显减少（比较IP，泳道3，4），这可能是由于c-fos在这些细胞中的相对表达减少（比较输入，泳道3，4）。这可能是由于HuR对c-fos表达的刺激作用所致(Fan and Steitz 1998年;Peng等人，1998年). 这一结果明确表明，在细胞破碎后，一个细胞群中表达的HuR与不同细胞群中的c-fos mRNA有效结合。
在上述实验中，分析的关联发生在蛋白质和目标RNA之间，这两种RNA的表达水平均高于其内源性对应物。因此，我们询问，广泛的再联系是否是由于两个结合伙伴的过度表达所致。在NIH/3T3细胞中，HuR-FLAG的表达水平明显低于内源性蛋白（图2B和内源性c-fos mRNA转录可被血清刺激诱导。图2B表明，无论蛋白质和RNA在相同或不同的NIH/3T3细胞群中表达，相似量的内源性c-fos mRNA都与HuR-FLAG相关，从而排除了过度表达作为观察到的重组的致病因素的作用。
A类。描述NIH/3T3细胞特定群体治疗的示意图。HuR-FLAG：用表达FLAG-tagged HuR的质粒转染（使用效应基因转染试剂，Qiagen）；-：用pcDNA3空载体转染。转染效率为~30%–40%。转染后24小时，所有细胞在含有0.3%牛血清的培养基中无血清培养24小时。如“血清刺激”所示，用20%的牛血清刺激细胞45分钟。B类.按中所述处理的细胞A类在PBS中被刮伤，并且在A类在裂解前混合。样品的溶解、免疫沉淀和分析如图1所示，除了免疫沉淀后，将相同数量的体外转录β-珠蛋白RNA添加到每个样品中，以控制后续步骤中RNA回收的差异。上部小组：RNase保护试验，使用与小鼠c-fos RNA最后一个外显子杂交的探针和与外源添加的β-珠蛋白RNA互补的探针进行。前两个通道：未消化探针（0.025%负载）和消化探针（100%负载）。下部小组：使用抗HuR的3A2单克隆抗体进行Western blot。注意，在使用的条件下，未刺激细胞的c-fos mRNA无法检测到（数据未显示）。
因此，这些数据表明，在细胞溶解后，HuR可以与c-fos mRNA重新关联，并且观察到的HuR与c-fos mRNA之间的关联主要来自细胞提取物中分子的相互作用。其他RNA-蛋白质复合体是否进行类似的重配以及重配的程度可能会有所不同，并取决于每个特定蛋白质对其RNA靶位点的亲和力、影响这种结合的因素的存在（例如通过协同作用）以及所用的特定实验条件。例如，类似的实验方法表明，与RNA-结合蛋白核仁蛋白相关的核糖核蛋白复合物在细胞裂解后不会发生显著的重排（F.Triolo和S.Pinol-Roma，pers.comm.）。
免疫或亲和纯化方法可以提供有关特异性和形成特定相互作用潜力的宝贵信息。然而，这里提供的数据表明，至少在某些情况下，这种相互作用可能不会反映复合物的体内状态，但可能由细胞裂解后产生的关联引起。虽然这种相互作用可能表明体内存在关联，但也可以在体外人工生成。例如，由于提取物中的分子可以自由扩散，因此可能会发生体内因差异分隔而阻止的相互作用。此外，具有重叠结合特异性的蛋白质的RNA结合活性在提取物中可能会受到不同的影响（因为每个相互作用对特定裂解条件、辅因子需求、翻译后修饰等的不同敏感性）。这可能导致体内无法接触到的结合位点暴露，或者相反，掩盖真正的相互作用位点。因此，考虑到这些可能性，我们建议在缺乏额外证据的情况下，在解释免疫净化实验中检测到的相关性时应谨慎，因为它们反映了真实的体内相互作用。
