Imperfect interface of Beclin1 coiled-coil domain regulates homodimer and heterodimer formation with Atg14L and UVRAG

doi:10.1038/ncomms1648

.2012年2月7:3:662。

doi:10.1038/ncomms1648。

Beclin1线圈结构域的不完善界面调节Atg14L和UVRAG同二聚体和异二聚体的形成

李晓华¹, 何立强, 嘉兴车, 莎拉·芬德伯克, Lifeng锅, 尼娜·潘, 张明杰, 岳振宇, 赵燕翔

附属公司

PMID： 22314358
预防性维修识别码：项目经理3293417
内政部： 10.1038/ncomms1648

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Beclin1线圈结构域的不完善界面调节Atg14L和UVRAG同二聚体和异二聚体的形成

李晓华等人。国家公社. 2012.

免费PMC文章

.2012年2月7日3:662。

doi:10.1038/ncomms1648。

作者

李晓华¹, 何立强, 嘉兴车, 莎拉·芬德伯克, Lifeng锅, 尼娜·潘, 张明杰, 岳振宇, 赵燕翔

附属

¹香港理工大学应用生物与化学技术系，手性科学国家重点实验室，香港九龙红磡。

PMID： 22314358
预防性维修识别码：项目经理3293417
内政部： 10.1038/ncomms1648

摘要

Beclin 1是III类磷脂酰肌醇3-激酶VPS34复合物的核心成分。Beclin 1的螺旋结构域是组装不同Atg14L-和UVRAG-复合物以调节VPS34活性的相互作用平台。在这里，我们报道了形成反平行二聚体的卷曲线圈结构域的晶体结构，并通过其卷曲线圈界面上的一系列“不完美”a-d配对使其亚稳态。Atg14L和UVRAG促进亚稳态同二聚体Beclin 1向异二聚体Beclin1-Atg14L/UVRAG-组装的转变。Beclin 1突变体的“不完美”a-d配对经过修饰以增强自我交互作用，与Atg14L或UVRAG的相互作用发生显著改变。这些结果表明，二聚体界面的特殊利用和Beclin 1相互作用伙伴对同二聚体-异二聚体转变的调节可能是控制Beclin 1-VPS34各种亚复合物形成的分子机制的基础，从而对VPS34相关的一系列活动产生影响，包括自噬。

PubMed免责声明

数字

**图1。Beclin 1 CC结构域及其不完全二聚体界面的结构。**
(一)不同物种Beclin 1 CC结构域序列的比对。彩色段和斜体*abcdefg公司*序列顶部显示了CC结构典型的七肽重复序列。序列下方的彩色球体表示一（橙色）和d日（蓝色）每七个重复的位置。(b条)Beclin 1 CC结构域的反平行二聚体CC结构。每个单体螺旋呈渐变色，N端为蓝色，C端为红色。斜体字母N个和C类指示N和C端子端。中心的圆点标志着CC畴结构的双重对称性。(**c（c）**)Beclin 1 CC结构域中13个七肽重复序列的螺旋轮呈现。仅绘制了7个七肽重复序列，代表了反平行对称二聚体的唯一一半。(d日)规范和不完美的特写一-d’配对。每种残留物都用球棒模型表示。主链原子为蓝色，副链原子为粉红色，代表典型配对，而副链原子则为金色，代表不完美配对。这个一-d’用描述侧链原子的范德瓦尔斯球体来说明填料。(**e（电子）**)Beclin 1 CC畴表面的静电分布。着色方案符合GRASP。椭圆突出了E224一-D221型e’排斥对。

**图2。Beclin 1 CC结构域是一个亚稳的同二聚体并介导其自结合*体内试验。*(一)Beclin 1 CC域的沉积平衡剖面。**
(b条)Beclin 1 CC畴在不同温度下的CD光谱。(**c（c）**). 野生型Beclin 1的动态交换分析。His-tagged和untagged Beclin 1 CC结构域在指定温度下共同培养，并在预设温度下由Ni共同沉淀²⁺–氨三乙酸（NTA）琼脂糖珠。SDS凝胶检查了异二聚体Beclin 1 CC结构域的存在，该结构域由一个带有his-tag的单体和另一个没有标记的单体组成，如箭头所示。(d日)Beclin 1的自联想模式体内将GFP-和AsRed标记的全长Beclin 1共转染到HEK 293T细胞中，用GFP抗体进行免疫沉淀，然后用抗AsRed抗体进行western blot，通过co-IP检测其自结合。

**图3。Beclin 1 CC结构域与Atg14L和UVRAG形成具有不同生物物理性质的异二聚体复合物。**
(一，b条)Atg14L对Beclin 1 CC结构域的ITC滴定曲线(一)或UVRAG(b条). (**c（c）**)下拉法评估Beclin 1–Atg14L和Beclin 1-UVRAG复合物之间的竞争。增加他的数量₆-将标记的Beclin 1 CC结构域添加到对应于其各自CC区域的Atg14L和UVRAG蛋白的混合物中。Beclin 1–Atg14L/UVRAG复合物被Ni拉下²⁺–氨三乙酸（NTA）琼脂糖珠，并通过SDS凝胶检查。(d日)Co-IP实验评估Beclin 1–Atg14L和Beclin 1–UVRAG复合物之间的竞争体内将FLAG或GFP标记的Atg14L或UVRAG单独转染或联合转染到HEK 293T细胞中，用GFP抗体通过co-IP检测其与内源性Beclin 1的相互作用，然后用抗Beclin l抗体进行western blot。

**图4。Beclin 1 CC结构域的单体（MutM）和稳定（MutStab）突变体的特征。**
(一)设计Beclin 1 CC结构域的单体（MutM）或稳定（MutStab）突变体的方案。野生型CC结构域二聚体在中心以两个反平行色条表示。两个条形图上的每个单独着色的片段代表一个七肽重复。颜色梯度是从N端的蓝色到C端的红色。为每个彩色段绘制两个灰色球体，表示一和d日形成二聚体界面的残基。权威人士一-d’MutM结构中变异的配对为黄色且不完美一-d’MutStab结构中突变的配对对于带电残基为红色，对于丙氨酸残基为绿色。(b条)Beclin 1 CC结构域野生型、MutM和MutStab构建物的估计分子量基于其各自的沉积平衡剖面（补充图S10）。(**c（c）**)Beclin 1的野生型、MutM和MutStab结构的自联想模式体内对于每个构建体，GFP-和Myc-标记的全长Beclin 1均被联合转染到HEK 293T细胞中，并使用IP的GFP抗体通过co-IP检测其自结合，然后使用抗Myc抗体进行western blot。(d日). Beclin 1 CC域野生型和MutStab构造在220 nm处的温度依赖性CD剖面。

**图5。Beclin 1 CC结构域的单体（MutM）突变体与Atg14L和UVRAG保持相互作用。**
(一，b条)Beclin 1野生型和单体（MutM）突变体与培养细胞中Atg14L或UVRAG的相互作用。仅用GFP标记的Beclin 1变体转染HEK 293T细胞(一)或与FLAG-UVRAG一起使用(b条). 用GFP抗体免疫沉淀裂解产物，然后用抗Atg14L抗体进行western blot分析，以检测与内源性Atg14L的结合(一)或使用抗UVRAG抗体检测与FLAG标记的UVRAG-蛋白的结合(b条).

**图6。Beclin 1 CC稳定（MutStab）突变体与Atg14L或UVRAG结合的差异。**
(一，b条)Beclin 1的MutStab突变体与Atg14L或UVRAG的相互作用体内将GFP标记的Beclin 1变体单独转染HEK 293T细胞(b条)或与FLAG-UVRAG一起使用(b条). 用GFP抗体对裂解产物进行免疫沉淀，然后用抗Atg14L抗体进行western blot分析，以检测与内源性Atg14L的结合(一)或使用抗UVRAG抗体检测与FLAG标记的UVRAG-蛋白的结合(b条).

**图7。Beclin 1 MutM和MutStab与共表达的Atg14L或UVRAG蛋白和早期自噬体标记物的亚细胞定位。**
(一，b条). 与GFP标记的Beclin 1野生型、MutM L178A/L192A或MutStab E189L/A217L/E224L/A255L（绿色）和AsRed–Atg14L（红色）共转化的HeLa细胞的代表性荧光图像(一)或FLAG-UVRAG（红色）(b条); AsRed–Atg14L与GFP标记的Beclin 1野生型或MutM的共定标显示在离散点中。(**c–e类**)共转染Myc-Beclin 1野生型、MutM L178A/L192A或MutStab E189L/A217L/E224L/A255L（蓝色）、AsRed–Atg14L（红色）和GFP标记的Atg12的HeLa细胞的代表性荧光图像(**c（c）**)，LC3(d日)和DFCP(**e（电子）**)（绿色）。比例尺为20μM。(**（f）**). Beclin 1的同型二聚体（反平行）与Beclin 1-Atg14L和Beclin 1-UVRAG的异二聚体之间动态转换的一个拟议模型，Beclin 1 CCD界面的亚稳态性质有助于Beclin l同型二聚体向Beclin 1-Atg14L/UVRAG异二聚体过渡，这与激活的自噬溶酶体降解相容。星形表明二聚体界面不完美。指向Beclin 1–UVRAG复合物的较粗箭头表明其亲和力更强。

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