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.2011年6月9日；70(5):847-54.
doi:10.1016/j.neuron.2011.04.001。

突触体素调节中枢神经元突触囊泡内吞动力学

宋永权 1, 埃德温·查普曼
附属公司

突触体素调节中枢神经元突触囊泡内吞动力学

宋永权等。 神经元. .

摘要

尽管突触素是最丰富的突触囊泡膜蛋白，但其功能仍不得而知。例如，据报道，突触素敲除小鼠的突触传递完全正常；然而，目前还没有进行直接的实验来监测突触囊泡周期。在这里，利用光学成像和电生理实验，我们证明突触素是培养海马神经元中突触小泡动态高效内吞所必需的。截短分析表明，突触素的不同结构元素在刺激期间和刺激后对小泡提取有不同的调节作用。因此，突触素调节至少两个内吞阶段，以确保在持续的神经元活动期间和之后囊泡的可用性。

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数字

图1
图1。Syp调节持续神经元活动停止后SVs的内吞作用
（A） 野生型（黑色）和西普在10 Hz下对300个刺激作出反应时，表达突触结合蛋白1-pHfluorin（syt1-pH）的−/−（白色）神经元。取3张盖玻片的平均值，每张20磅。（B） 野生型（黑色）和西普表达SV2A-pHfluorin（SV2A-pH）的−/−（白色）神经元对100个10 Hz的刺激作出反应。平均6张盖玻片，每张30磅。（C） 荧光图像显示突触前波顿在wt和西普−/−神经元，在10 Hz刺激前（t=0）和停止刺激后（t=41s或80s）持续30秒。“t”表示图水平轴上的一个时间点，如(B). 比例尺为2μm。（D） 的平均SV2A-pH记录道西普−/−（白色，6个盖玻片，每个30个鲍顿）和wt-型救援（灰色，5个盖玻板，每个30鲍顿）神经元对100个10 Hz的刺激作出反应。（E） 野生型（黑色）和西普−/−（白色）神经元对10 Hz的50个刺激作出反应。取4张盖玻片的平均值，每张40磅。（F） 野生型、，西普−/−和wt-型救援神经元。将所有ΔF值归一化为最大荧光强度变化。在归一化之前，用单指数函数拟合来自syt1 pH或SV2A pH的ΔF迹线的衰变相，并根据拟合计算时间常数。（G） FM 1-43脉冲相位实验协议。以10 Hz的频率刺激神经元30 s。在短暂延迟（30 s）后，将神经元暴露于FM 1-43中3 min，然后在Ca中清洗2+溶液10分钟。输送两列900个脉冲（10Hz）以引起FM 1-43的卸载。休息10分钟后，在FM 1-43的存在下以10 Hz的频率刺激神经元30 s。随后以与第一轮相同的方式进行清洗和卸载。（H） 显示延迟加载（左侧面板）和最大加载（右侧面板）期间标有FM 1-43的boutons的示例图像。比例尺为1.5μm。（一） 平均ΔF1/ΔF2重量比和西普−/−神经元。取4张盖玻片的平均值，每张40磅。所有误差条均为SEM。**，p<0.001（双尾，未配对t吨-测试）。
图2
图2。持续突触传递期间的细胞内吞减少西普−/−神经元
（A） 使用巴非霉素（Baf）测量神经元活动期间内吞作用的时间进程和程度的协议，以防止囊泡再次酸化。在没有Baf的情况下，以10 Hz的频率刺激表达SV2A-pH的神经元30 s。休息10分钟后，在Baf存在下以10 Hz的频率刺激神经元120 s。在刺激的每个阶段都采集图像。（B） 在10 Hz下，wt神经元对300个刺激的平均SV2A-pH轨迹。痕迹代表6个盖玻片的平均值，每个盖玻片30磅。在Baf存在的情况下，值被归一化为1200次刺激结束时的最大荧光变化。短箭头和长箭头（也在(C类)和(天))分别以10 Hz表示300个刺激结束时的内吞和外吐程度（垂直虚线）。（C） 同样的实验在西普−/−神经元（6个盖玻片，每个30磅）（D）在重量型救援样本中重复相同的实验（5个盖玻片，每个三十磅）。（E） wt的胞吐（Baf）和内吞的时间进程，梅毒−/−和wt-syp在刺激过程中拯救神经元（30s，10Hz）。通过从面板中的“Baf”轨迹减去在没有Baf的情况下获得的SV2A-pH轨迹来计算每个内吞时间过程(B–D类). 用线性函数拟合细胞内吞痕迹（实线显示为“wt”的示例）。通过计算拟合线的斜率，根据经验确定内分泌率。（F） 根据(E类). （G） 输送300次脉冲后，作为胞吐分数的平均内吞量。（H） 通过拟合面板中Baf痕迹的上升期估计平均外显时间常数(B–D类)具有单指数函数。所有误差条均为SEM.**，p<0.001。
图3
图3。突触素的C末端胞质尾部在持续神经元活动期间调节内吞作用，但对刺激后内吞作用并不重要
（A） （左）的平均SV2A-pH记录道西普−/−（白色，6个盖玻片，每个30磅）、重量型救援（黑色，5个盖玻片，每个三十磅）和ΔC-syp神经元（灰色，5个盖玻片，每一个三十磅），对10 Hz的300个刺激作出响应。（右）刺激后平均内吞时间常数的比较西普−/−、wt-syp救援和ΔC-syp神经元。（B） 使用图2所示的相同方案分析神经元活动期间的细胞内吞(一个). 每个记录道是与中相同数量的样本的平均值(一个). 以下患者胞吐（Baf）和胞吞的时间进程西普30 s刺激方案中的−/−（左）、wt-syp救援（中）和ΔC-syp神经元（右）。（C） 以下患者胞吐（Baf）和胞吞的时间进程西普在10 Hz的30 s刺激期间，−/−，wt-syp拯救ΔC-syp神经元。每个内吞作用时间过程的计算方法是，将在没有Baf的情况下获得的SV2A-pH轨迹从三个面板中每个面板的“Baf”轨迹中减去(B). 通过用线性函数拟合斜率来确定内吞率，如图2所示(E类). （D） 根据(C类). （E） 传递300个刺激后，作为胞吐分数的平均内吞量。所有误差线均为SEM.*，p<0.05，**，p<0.001。
图4
图4。突触抑制和恢复的时间进程西普−/−神经元
（A） wt（顶部）和西普在3 mM Ca中以10 Hz进行100次刺激期间的−/−（底部）2+.（B）（顶部）wt（黑色）和西普持续10 Hz刺激期间的−/−（白色）神经元。数值为7 wt和7 wt的平均值西普−/−神经元。振幅值标准化为列车中的第一个响应。（底部）为了清楚起见，显示了10 Hz刺激期间前20个响应的平均值。（C） 在3 mM Ca中以10 Hz频率100次刺激时wt-syp（Top）和ΔC-syp（Bottom）神经元中IPSC的代表性痕迹2+（D）wt-syp救援（灰色）和ΔC-syp神经元（灰色三角形）的归一化IPSC振幅与wt和西普−/−数据来自(B). 值是8 wt-syp和6ΔC-syp样品的平均值。（E） 囊泡池回收实验中IPSC的代表性痕迹。神经元受到两个不同阶段的刺激：在4 mM Ca中以10 Hz的频率进行200次刺激2+循环SV池的最大消耗，然后在0.5 Hz的轻度刺激下进入恢复阶段。（F） wt（黑色）和西普恢复期的−/−（白色）神经元。振幅值归一化为耗尽阶段的第一响应，并用单指数函数拟合。数值为8 wt和8 wt的平均值西普−/−神经元。所有误差条均为SEM。
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