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审查
.2010年3月；48(3):197-209.
doi:10.2144/000113382。

抗体验证

詹妮弗·波尔多 1, Allison威尔士语, 西玛·阿加瓦尔, 伊丽莎白·基利亚姆, 玛丽亚·巴奎罗, 杰森·汉纳, 瓦尔萨莫·阿纳诺斯图, 大卫·里姆
附属公司
审查

抗体验证

詹妮弗·波尔多等。 生物技术. 2010年3月.

勘误表in

  • 生物技术。2010年5月；48(5):351

摘要

抗体是基础科学研究和临床检测中最常用的工具之一，但目前还没有公认的指南或标准化方法来确定这些试剂的有效性。此外，对于商用抗体，很明显标签上的内容不一定与试管中的内容一致。为了验证抗体，必须证明其在使用环境中具有特异性、选择性和可重复性。在这篇综述中，我们强调了使用抗体时的常见陷阱、验证抗体的常见做法以及七家供应商的商业抗体验证水平。最后，我们分享了免疫组织化学和定量免疫荧光抗体验证的算法。

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数字

图1
图1。HoxA1和磷酸-4EBP1的非特异性抗体的实例
（A） 细胞裂解物变性并通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素中，并用抗HoxA1的小鼠多克隆抗体进行印迹。在CaCo2裂解液中可以看到预期分子量的条带（用箭头标记）。请注意，所有细胞系中的许多条带的分子量都出乎意料。（B） HoxA1在FFPE乳腺癌组织上的IHC染色的代表性示例。注意细胞核转录因子的细胞质染色。（C） 磷酸化-4-EBP1的蛋白质印迹。箭头表示预期分子量的带；同样，所有裂解物在意料之外的分子量下都显示出许多条带。（D） 在FFPE肺癌组织上进行IHC染色以检测p-4EBP1的典型示例。请注意，蛋白质主要定位于细胞核和细胞质。
图2
图2。VEGF VG-1克隆抗体缺乏再现性
（A） VG-1（1:50稀释）对FFPE肺癌组织的IHC显示预期定位的特异染色。（B） VG-1（1:50）染色的肺TMA连续切片彼此无关。相同患者组织连续切片的（C，D）IHC染色在第1次运行（C）中显示高阳性，在第2次运行（D）中VEGF为阴性。插图表示肿瘤的细胞角蛋白染色，以供参考。
图3
图3。用于IHC/QIF抗体验证的Rimm Lab算法
抗体验证的第一步是使用体外细胞系测试抗体特异性。第2步（虚线下方）涉及进一步验证组织芯片（TMA）上的抗体，以确定分析运行和不同抗体批次之间的预期目标定位和再现性。
图4
图4。siRNA降低Stathmin的表达
（A） 模拟24小时后BT-20裂解物的WB；控制干扰siRNA或Stathmin siRNA转染显示Stathmin水平的特异性降低。GAPDH用作加载控制。（B） BT-20细胞在转染后24小时用扰乱的对照或Stathmin siRNA固定在4%PFA中，并且用Stathmin的IF显示Stathmin表达降低。
图5
图5。ER-α抗体克隆1D5是定量WB和IHC方法之间强相关性的一个例子
（A） 用1D5（1:50稀释）染色的FFPE MCF7细胞显示ER-α的预期核定位。（B） 一组乳腺癌细胞系的WB和1D5显示ER-a的不同表达。Puro细胞是稳定表达可诱导ER-α的MCF7细胞。β-微管蛋白作为负载对照。（C） 使用ImageJ对WB的ER-α表达进行量化，并与细胞裂解物对应的AQUA评分相关，显示出很强的相关性。
图6
图6。重复测定和抗体批次之间的可重复抗体的实例
（A） 在乳腺指数TMA上使用MAP-tau单克隆抗体显示了批对批的再现性。（B） 中东和北非有一个R（右）2当在我们的肺TMA连续切片上染色时，值为0.932，表明在不同的日子使用相同批次和稀释的抗体进行的检测中具有较高的重复性。
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