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.2009年2月；11(2):143-53.
doi:10.1038/ncb1819。 Epub 2008年12月21日。

SRF和肌球蛋白调节LRP介导的脑血管细胞淀粉样蛋白β清除

罗伯特·D·贝尔 1, 拉希德·迪恩, 周念文, 龙晓春, Abhay Sagare公司, 伊滕德·辛格, 杰弗里·斯特雷布, 黄果, 安娜·鲁比奥, 威廉·范·诺斯特兰德, 约瑟夫·米亚诺, 贝里斯拉夫·兹洛科维奇
附属公司

SRF和心肌蛋白调节脑血管细胞LRP介导的淀粉样β清除

罗伯特·D·贝尔等。 Nat细胞生物学. 2009年2月.

摘要

淀粉样β肽（Abeta）在脑血管中的沉积与阿尔茨海默病（AD）患者的脑淀粉样血管病（CAA）有关。在此，我们报告了在AD患者和两种AD小鼠模型中，脑血管平滑肌细胞（VSMCs）中血清反应因子（SRF）和肌钙蛋白（MYOCD）的过度表达通过甾醇调节元件结合蛋白-2的反式激活产生Abeta非清除VSMC表型，下调低密度脂蛋白受体相关蛋白-1，这是一种关键的阿贝塔清除受体。缺氧刺激了人脑VSMC和AD动物模型中SRF/MYOCD的表达。我们认为SRF和MYOCD作为转录开关发挥作用，控制Abeta脑血管清除和AD进展。

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数字

图1
图1
SRF和MYOCD过度表达可阻断人类大脑VSMC对Aβ的清除。(一)多点玻璃载玻片的多光子/共焦激光扫描显微镜，涂有Cy3标记的Aβ42，无细胞（左侧面板），涂有AD患者和年龄匹配的对照组的大脑VSMC（右侧面板），持续生长5天。(b条)用AD.sh转导的AD患者的VSMCGFP公司或Ad.sh战略参考框架在MOI 100下，在Cy3-Aβ42涂层表面上电镀和生长5天，并通过共焦显微镜成像。(c（c）)VSMC来自Ad。GFP公司或广告。MYOCD公司在Cy3-Aβ42涂层表面上电镀并生长5天，并通过共焦显微镜成像。比例尺，50µm(a–c). (d日)AD和年龄匹配对照VSMC中SRF和MYOCD的Western blot与载体孵育并与AD.sh转导GFP公司和Ad.sh战略参考框架或广告。GFP公司和广告。MYOCD公司分别是。通过扫描密度计测定的相对表达水平显示在印迹下方（3-4个独立培养物的平均值±标准偏差）。(e（电子）)5天后，对照组VSMC、非转导或Ad转导的Cy3-Aβ42在多点载玻片上的相对信号强度。GFP公司或广告。MYOCD公司（黑色条），并且AD VSMC未转导或与AD.sh转导GFP公司或Ad.sh战略参考框架（开放式酒吧）。显示了7-8种独立培养物的平均值±标准偏差。(（f）)Cy3-Aβ40在未转导或用Ad转导的对照VSMC中5天后的相对信号强度。GFP公司或广告。MYOCD公司（黑条），与AD VSMCs（开条）相比。显示了3-4种独立培养物的平均值±标准偏差。在e（电子）和（f）无细胞玻片（灰条）中的信号强度任意取100%。western blot数据的完整扫描如补充信息所示，图S4。
图2
图2
大脑VSMC中的LRP被SRF和MYOCD下调。(一)用载体和LRP特异性阻断抗体处理的对照VSMC中Cy3-Aβ42内化和溶酶体共定位的多光子/共焦激光扫描显微镜观察。细胞跟踪器，蓝色；Cy3-Aβ42，红色；Lysotracker，绿色。显示合并图像（黄白色是Aβ与溶酶体的共定位）。比例尺，20µm。(b条)对照组和AD脑VSMC中的LRP水平，以及用AD.sh转导的AD VSMC中LRP水平GFP公司和Ad.sh战略参考框架. (c（c）)实时定量PCR（qPCR）LRP公司AD VSMCs中的mRNA单独（载体）和AD.sh转导GFP公司或Ad.sh战略参考框架. (d日)用Ad转导的对照VSMC中的LRP水平。GFP公司或广告。MYOCD公司. (e（电子）)实时qPCRLRP公司mRNA在对照组VSMC中单独表达（载体）并用Ad转导。GFP公司或广告。MYOCD公司数据表示每组3种独立培养物的平均值±标准偏差(b–e类).
图3
图3
SRF和MYOCD通过SREBP2的定向表达抑制LRP。(一)PAC1 VSMC中SREBP2荧光素酶活性与荧光素酶报告子包含启动子（1253）、启动子加内含子1（1254）或启动子加上内含子1，人类SREBP2的CArG盒均发生突变（1271），带有pcDNA载体和EMSV载体（对照）或带有MYOCD和SRF过表达质粒。(b条)与对照组VSMC相比，AD VSMC核SREBP2（绿色）水平增加，LRP（红色）细胞表达降低（参见d日). 用AD.sh转导AD VSMC后，核SREBP2水平降低，LRP表达增加战略参考框架但不是Ad.shGFP公司细胞核DAPI染色显示为白色。比例尺，20µm。(c（c）)western blot分析法测定AD.sh转导的AD VSMC中SRF、SREBP2（细胞质长型和短核型）和LRP水平GFP公司和Ad.sh战略参考框架. (d日)与AD VSMC相比，对照组VSMC的核SREBP2（绿色）水平较低，LRP（红色）的细胞表达增加（参见b条). 用Ad转导对照VSMC后，核SREBP2增加，LRP表达降低。MYOCD公司，但与广告无关。GFP公司核DAPI染色为白色。比例尺，20µm。(e（电子）). 用Ad转导对照VSMC后，通过western blot分析测定SRF、SREBP2（细胞质长型和短核型）和LRP水平。GFP公司或广告。MYOCD公司中的图形c（c）和e（电子）显示相对于β-actin的带密度。(（f）)转染对照siRNA的对照VSMC中SREBP2和LRP水平CTRL键)或SREBP2号机组siRNA（siSREBP2号机组)然后用Ad进行转导。GFP公司或Ad。MYOCD公司图中显示了测试蛋白相对于β-肌动蛋白的带密度。(克)实时qPCRLRP公司转染对照siRNA（siRNA）的对照VSMC中的mRNACTRL键)或SREBP2号机组siRNA（siSREBP2号机组)随后用任一Ad。GFP公司或广告。MYOCD公司数据代表9种独立培养物的平均值±标准偏差；值被标准化为内部肾小球对照(一)，或每组3种独立培养物的平均值±标准偏差(c（c）,e–g). 面板f中western blot数据的完整扫描如补充信息图S4所示。
图4
图4
MYOCD公司软脑膜动脉过度表达抑制小鼠局部LRP介导的Aβ清除。(一,b条)通过western blotting测定术后分离的脑软脑膜血管中MYOCD、SRF、平滑肌α-肌动蛋白、平滑肌钙蛋白、SREBP2和LRP水平体内用Ad进行转导。GFP公司或广告。肌体在5个月大的C57Bl6小鼠中(一). 图表显示了测试蛋白相对于β-肌动蛋白的带密度（每组5只动物的平均值±标准偏差），b条). (c（c）)软脑膜血管核SREBP2和细胞LRP的免疫细胞化学染色肌体基因转移。LRP，红色；SREBP2，绿色；TO-PRO3，灰色。比例尺，20µm。(d日,e（电子）)的影响MYOCD公司小鼠软脑膜血管内源性Aβ42水平的过度表达(d日)并集中在大脑中(e（电子）). 每个点代表一个单独的动物值。western blot数据的完整扫描如补充信息所示，图S4。
图5
图5
战略参考框架将基因转移到软脑膜动脉可降低AD模型中的Aβ病理学改变。(一)在表达对照载体（Ad.sh）后，转导的软脑膜血管（上面板）和脑组织（下面板）中的Aβ免疫染色GFP公司)或Ad.sh战略参考框架在24个月大的荷兰/爱荷华州应用程序老鼠。比例尺，50µm。(b条,c（c）)转导软脑膜血管中的Aβ负荷(b条)并集中在大脑中(c（c）)腺病毒介导的sh转移后GFP公司或sh战略参考框架在24个月大的荷兰语/爱荷华州应用程序老鼠。(d日,e（电子）)转导软脑膜血管的淀粉样物质负荷(d日)以及脑内局部Aβ40和Aβ42水平(e（电子）)腺病毒介导的sh转移后GFP公司和sh战略参考框架在24个月大的荷兰语/爱荷华州应用程序老鼠。(（f）)sh过度表达后软脑膜血管中SREBP2、未成熟LRP（LRP600带）和成熟LRP的水平GFP公司和sh战略参考框架在24个月大的荷兰语/爱荷华州应用程序老鼠。图中显示了与β-肌动蛋白相比的相对带密度。(克)双光子体内16个月大婴儿大脑皮质第一层淀粉样蛋白的甲氧基-XO4纵向成像和德克萨斯红葡聚糖血管造影应用软件±在软脑膜血管中用Ad.sh局部转导的小鼠GFP公司或Ad.sh战略参考框架.比例尺，100µm。图表显示XO4相对信号强度。(小时)Ad.sh转导的软脑膜血管所在区域的Aβ40和Aβ42局灶性脑水平GFP公司或Ad.sh战略参考框架16个月大应用软件±老鼠。数据表示每组5只动物的平均值±标准偏差(b–d段,f–h).
图6
图6
MYOCD公司荷兰/爱荷华州软脑膜动脉过度表达加重Aβ病理学应用程序老鼠。(一)Ad转移后软脑膜血管中的Aβ40和Aβ42水平。GFP公司和广告。MYOCD公司。每个点代表一个单独的值。(b条)在表达对照载体（Ad。LacZ公司)或Ad。MYOCD公司.比例尺，50µm。(c（c）)Ad转移后，转导的软脑膜血管和脑局部的Aβ负荷。LacZ公司或广告。MYOCD公司. (d日)Ad转导后软脑膜血管淀粉样蛋白负荷。LacZ公司或广告。MYOCD公司. (e（电子）)软脑膜血管中SREBP2长型和短型、未成熟LRP（LRP600带）和成熟LRPGFP公司和MYOCD公司图中显示了与β-肌动蛋白相比的相对带密度。数据表示每组5只动物的平均值±标准偏差(c–e类).MYOCD公司和GFP公司基因转移在15个月大的荷兰人/爱荷华州进行应用程序老鼠。
图7
图7
缺氧增加了人大脑VSMC和软脑膜血管中MYOCD和SRF的表达应用软件±老鼠。(一)PAC1 VSMC中MYOCD荧光素酶活性萤光素酶报告者，在人类启动子区有或没有缺氧反应元件（+HRE或−HRE）MYOCD公司基因。细胞在常压或低氧（1%O）下培养48小时2)条件。(b条)转染后PAC1细胞中MYOCD荧光素酶活性荧光素酶人类启动子区有无HRE的报告者MYOCD公司并与pcDNA载体或HIF-1α过表达质粒共转染。细胞在常压条件下培养48小时。(c（c）)实时qPCRMYOCD公司正常或低氧（1%O2)条件。(d日)正常氧或缺氧48小时内，对照脑VSMC的MYOCD、SRF和LRP水平。(e（电子）)缺氧48小时内人类VSMC中SREBP2（绿色）的核移位和LRP（红色）的下调。核DAPI染色为白色。比例尺，20µm。(（f）)5-6个月大的孤立软脑膜血管中MYOCD、SRF、SREBP2和LRP水平应用软件±小鼠缺氧（10-8%氧气）或常压（21%氧气）2周。(克)实时qPCRMYOCD公司和LRP公司分离的软脑膜血管中的mRNA应用软件±被视为（f）. (小时)离体软脑膜血管中Aβ40和Aβ42的水平应用软件±小鼠处于缺氧或常氧状态，如（f）在中，数据表示每组3种独立培养物的平均值±标准偏差(a–d)或每组5只动物的平均值±标准偏差(f–h).
图8
图8
SRF和MYOCD控制血流量和脑淀粉样血管病（CAA）。(一)对脑血流（CBF）的影响。AD患者脑VSMC中SRF和MYOCD的过度表达通过直接表达调节Ca的SRF-依赖基因稳定VSMC超收缩表型2+内稳态，例如肌球蛋白轻链激酶(聚酯树脂)，固钙素1(外壳1)，肌浆/内质网钙ATP酶2(ATP2A2型)和SRF-MYOCD调节的平滑肌（SM）收缩基因，例如SM肌球蛋白重链(MHC公司)，山猫α-肌动蛋白,SM22α和SM钙调素导致动脉收缩过度和脑血流量（CBF）减少。(b条)CAA的病理效应。SRF和MYOCD通过定向表达SREBP2促进Aβ非清除性VSMC表型，SREBP2是Aβ主要清除受体LRP的转录抑制因子。该途径导致CAA的发展，并限制脑组织中Aβ的局部清除，从而导致局部Aβ脑蓄积。
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