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.2008年8月22日；283(34):23235-43.
doi:10.1074/jbc。米7099748200。 Epub 2008年6月24日。

小泛素样修饰物对心脏特异性nkx2.5基因活性的调节

王军（Jun Wang） 1, 华章, 迪纳卡尔·伊耶, 新华丰, 罗伯特·施瓦茨
附属公司

小泛素样修饰物对心脏特异性nkx2.5基因活性的调节

王军（Jun Wang）等。 生物化学杂志. .

摘要

心脏特异性同源异型盒基因nkx2.5是nk-2家族的成员，在心脏发生中起着核心作用，是小泛素样修饰物（SUMO）的靶点。SUMO对Nkx2.5的第51个氨基酸进行了修饰，该氨基酸是一种跨物种保守的赖氨酸残基，但在其他nk-2成员中不存在。这种赖氨酸转化为精氨酸（K51R）大大降低了Nkx2.5 DNA结合及其转录活性。出乎意料的是，突变体K51R被泛素靶向。E3连接酶PIAS蛋白PIAS1、PIASx和PIASy（而非PIAS3）增强了SUMO-1在主要SUMO受体位点上与Nkx2.5的连接。SUMO-2与Nkx2.5的连接仅由PIASx催化，而不是由其他PIAS蛋白催化。SUMO结合稳定了Nkx2.5复合物的形成，从而导致强烈的转录激活。因此，SUMO修饰是Nkx2.5转录活性的正调控因子。

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数字

图1。
图1。
SUMO-1通过共价键上调Nkx2.5转录活性修改。 A类，Nkx2.5表达载体（0.5μg）为在不存在或存在增加剂量的情况下共同转染到CV1细胞基于质粒的SUMO-1表达载体（0.25、0.5、0.75和1μg，如图所示，与Ca-actin-Luc报告子结构一起使用。数据表示为至少两个独立样本的平均值±S.E化验，每个化验两次。内部每个组上显示的值这个面板指示-折叠激活。这个下面两个面板显示了转染Nkx2.5和FLAG-tagged的表达水平SUMO-1在12孔板的每个相应组中。GAPDH作为内部控制。B类，Nkx2.5由SUMO-1修改体内.Western blot在转染HeLa细胞的细胞裂解物上进行存在或不存在SUMO-1或SUMO-1时的Nkx2.5编码载体ΔGG，如图所示。顶部，用抗Nkx2.5抗体印迹；底部，用抗SUMO-1抗体印迹。C类,镍2+-NTA分析证实存在SUMO-1-共轭Nkx2.5。伊斯6-标记的Nkx2.5与Ni沉淀2+-NTA。注释抗FLAG抗体显示的蛋白带位置(底部)相当于显示的迟缓迁移带抗Nkx2.5抗体(顶部).天，外源性Nkx2.5被修饰内源性SUMO蛋白。镍2+-对COS-7细胞进行NTA转染了他的6-标记的Nkx2.5表达载体。这个用抗Nkx2.5抗体显示代表性印迹。这个上面的和下部箭头指向SUMO结合和自由伊斯6-分别标记为Nkx2.5。
图2。
图2。
赖氨酸51是SUMO-1的主要结合位点。 A类,Nkx2.5共识SUMO靶序列的示意结构跨物种。这个带下划线的字母指示SUMO联动装置现场。B类，赖氨酸51的突变消除了SUMO-1修饰Nkx2.5。对含有Nkx2.5野生型的细胞裂解物进行Western blot或K51R突变，在没有或存在SUMO-1表达载体的情况下，如表明。顶部，慢迁移带（SUMO-1-共轭Nkx2.5）在含有Nkx2.5野生型和SUMO-1的组中存在，但在含有K51R突变体和SUMO-1的组（比较车道3和5). 这个下部面板在每个对应的组。C类，K51R突变体表现出较低的SUMO-1存在下的转录活性。荧光素酶活性测定在转染WT Nkx2.5的CV1细胞的全细胞裂解物上进行或K51R（各0.5μg），在不存在或存在剂量增加的情况下SUMO-1表达载体（分别为0.25、0.5和1μg），如图所示。所示数据表示为至少两个独立数据的平均值±S.E每项测定一式两份。这个数字展示内部每个酒吧上方这个面板指示-折叠激活每个组。这个下部三个面板显示了转染Nkx2.5 WT、K51R和FLAG-tagged SUMO-1的表达水平每组对应的12孔板。GAPDH作为内部控件。
图3。
图3。
PIAS1增强了Nkx2.5对赖氨酸51的SUMO-1修饰。 A类，对仅含Nkx2.5的细胞裂解物进行Western blot或存在SUMO-1、SUMO-1/PIAS1或SUMO-1/PIAS1环突变体时表明。注意，仅在存在Nkx2.5/SUMO-1/PIAS1，而不存在RING域突变。B类,镍2+-NTA分析证实多条延迟带SUMO-1-共轭Nkx2.5。伊斯6-标记的Nkx2.5单独转染或在缺乏或存在PIAS1表达的情况下使用FLAG-tagged SUMO-1载体进入HeLa细胞并与Ni沉淀2+-NTA。顶部，抗Nkx2.5抗体在游离Nkx2.5%以上出现多条带；底部，抗FLAG抗体在这些位置显示出多条带相当于顶部.C类、PIAS1在SUMO-1存在下增强了Nkx2.5转录活性。在转染了多种病毒的CV1细胞中测定了报告活性如图所示，Nkx2.5、SUMO-1、PIAS1或PIAS1 RING突变体的组合。所示数据表示为至少两个独立数据的平均值±S.E每种检测重复进行一次（Nkx2.5或K51R，0.5μg；SUMO-1，0.75微克；PIAS1分别为0.05和0.1μg；PIAS1 mut，0.1μg）。这个数字展示内部每个酒吧上方这个面板指出每组的-fold激活。这个下部三个面板显示了转染Nkx2.5 WT、PIAS1 WT和mut的表达水平，以及在12孔板的每个相应组中，用FLAG标记SUMO-1。中的GAPDH同一个污点用作内部控制。这个箭头在中中间面板表示SUMO-1-共轭PIAS1 WT。天,PIAS1促进赖氨酸51的酰化。对如图所示，HeLa细胞裂解物含有各种表达蛋白。注释赖氨酸51的突变通过SUMO-1/PIAS1显示出最小的sumoylation。
图4。
图4。
Nkx2.5与PIAS1的物理关联。 A类,联合免疫沉淀显示PIAS1和Nkx2.5。对细胞裂解物进行共免疫沉淀包含使用IgG或Nkx2.5标记的FLAG PIAS1和Nkx2.5抗体。B类，Nkx2.5的C末端与PIAS1相互作用。GST保险丝固定在GST珠上的PAIS1与含有如图所示，各种Nkx2.5版本的编码向量。C类，N个PIAS1末端与Nkx2.5相互作用。GST融合Nkx2.5固定到GST珠子与[35S] 蛋氨酸标记的PIAS1 WT或其如所示的各种突变体。
图5。
图5。
SUMO连接站点通过多个机制。 A类，赖氨酸51对Nkx2.5 DNA结合至关重要。安用全细胞裂解物进行电泳迁移率变化分析包含野生型Nkx2.5或K51R突变的两个Nkx2.5DNA结合顺序如图所示。这个右侧小面板显示等效值Nkx2.5野生型和K51R的表达。B类，K51R突变体被靶向通过泛化。左侧，他的6-标记为Nkx2.5野生型或联合转染泛素表达载体的K51R被镍2+-NTA和Western blot中抗Nkx2.5抗体显示。赖特，Nkx2.5野生型或K51R突变与伊斯6-表位泛素被镍拉下2+-NTA和Western blot中的抗Nkx2.5抗体显示。优步，泛素。C类与野生型Nkx2.5相比，K51R活性较低。对含有Ca-actin-Luc报告基因以及Nkx2.5野生型的增加剂量类型或K51R突变，如图所示（三个增加剂量：0.5、0.75和1μg）。这个数字展示内部每个酒吧上方这个面板指出每组的-fold激活。这个下面两个面板显示了转染Nkx2.5 WT和K51R在各组中。GAPDH起到了内部控制的作用。抗体，抗体。
图6。
图6。
SUMO-1共轭重塑了含Nkx2.5的复合物的形成。 A类，SUMO-1-缀合的Nkx2.5与游离的Nkx2.5均二聚。从全细胞裂解物中获得的SUMO-1结合血凝素标记的Nkx2.5含有所示的各种表达蛋白，与GST或GST融合Nkx2.5固定到GST珠。用Nkx2.5显示印迹抗体。B类，对从使用含有多种成分的细胞裂解液的尺寸排除色谱法如图所示的蛋白质组合。这个星号指出含有Nkx2.5的蚀变络合物（游离或SUMO-1-附着或两者兼有）。C类，K51R通过竞争与野生型Nkx2.5异二聚体。顶部，K51R与GST-Nkx2.5发生物理相互作用，但不只是GST。底部，K51R通过竞争与野生型Nkx2.5异二聚体抗Nkx2.5同二聚体。天，K51R没有表现出任何协同作用WT Nkx2.5。对细胞裂解物进行荧光素酶活性测定转染不同剂量的WT Nkx2.5或K51R突变体，如图所示。请注意，K51R替换了一定数量的WT Nkx2.5与未激活的启动子相比，未能激活测试的启动子更换。所示数据表示为至少两个数据的平均值±S.E独立分析，每次重复进行。这个数字展示内部每个酒吧上方这个面板指示-折叠激活每个组。这个下部面板显示了相对转染的V5-His的表达水平6-每个Nkx2.5 WT和K51R12孔板中的相应组。同一斑点中的GAPDH用作内部控制。
图7。
图7。
PIAS1家族成员对两种底物都有多重特异性和SUMO亚型。 A类，PIAS1、-xα、-xβ和-y，但不是PIAS3刺激SUMO-1结合至Nkx2.5。体内SUMO化对仅含Nkx2.5或在五个PIAS家族中的一个缺席或在场的情况下，与SUMO-1一起成员，如图所示。顶部，多重的存在SUMO-1与PIAS1、-xα、-xβ和-y共轭的Nkx2.5，但不与PIAS3。中间和底部，可比较的表达水平PIAS蛋白和SUMO-1。B类，Nkx2.5是一个薄弱目标SUMO-2/3编制。这个顶部显示Nkx2.5修改大大减少SUMO-2/3型与SUMO-1。底部，的可比表达式每组SUMO-1、-2和-3。C类、PIASxα和-xβ，但不是其他PIAS蛋白催化SUMO-2对Nkx2.5进行修饰。顶部,Nkx2.5抗体显示SUMO-2修饰的强烈刺激PIASxα和-xβ（比较车道2具有车道5和6). 这个中间的和底部显示可比较各组PIAS蛋白和SUMO-2的表达。
图8。
图8。
SUMO-1刺激了Nkx2.5和SRF之间的功能联系。 A类和B类，Ca-actin-Luc活性在Nkx2.5、SRF和剂量SUMO-1表达载体的各种组合转染CV1细胞(A类)或各种野生型组合Nkx2.5和SRF或其SUMO位点突变体转染CV1细胞带有SUMO-1表达载体(B类).A类，的后三名面板显示转染Nkx2.5、SRF、K51R和在每个相应的组中，用FLAG标记SUMO-1。在相同的印迹中提供GAPDH作为内部控制。这个数字展示每个酒吧上方里面这个面板指出每组的-fold激活。C类，凝胶过滤显示出不同的模式在SUMO-1存在下从这些化合物中形成的Nkx2.5-SRF复合物在没有或存在SUMO-1ΔGG的情况下形成。赖特和左边各相应分数中SRF和Nkx2.5的水平，分别。这个星号在在缺乏野生型SUMO-1的情况下不存在的复合物。这个箭头表示Nkx2.5在SUMO-1的存在，而转染的蛋白在每组，如输入20μg细胞裂解物所示。
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