Transforming growth factor-beta promotes invasion in tumorigenic but not in nontumorigenic human prostatic epithelial cells

doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-4451

.2006年8月15日；66(16):8007-16.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-4451。

转化生长因子-beta促进致瘤性前列腺上皮细胞侵袭，但不促进非致瘤性人类前列腺上皮细胞的侵袭

奥明芳¹, 卡林·威廉姆斯, 尼尔·A·博米克, 西蒙·海沃德

附属公司

PMID： 16912176
预防性维修识别码：项目经理4067141
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-05-4451

转化生长因子-beta促进致瘤性前列腺上皮细胞侵袭，但不促进非致瘤性人类前列腺上皮细胞的侵袭

奥明芳等。癌症研究. 2006.

.2006年8月15日；66(16):8007-16.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-4451。

作者

奥明芳¹, 卡林·威廉姆斯, 尼尔·A·博米克, 西蒙·海沃德

附属

¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心癌症生物学系，邮编37232-2765。

PMID： 16912176
预防性维修识别码：项目经理4067141
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-05-4451

摘要

转化生长因子β（TGF-β）是一种多效性生长因子，其作用取决于环境，包括剂量、靶细胞类型和环境。TGF-β可以诱导生长促进和生长抑制活性。在正常组织中，TGF-β通常起到限制生长和维持分化的作用。然而，在肿瘤发生过程中，TGF-β表达和细胞反应的变化可以促进肿瘤发生。本研究检测了TGF-β对非致癌人前列腺上皮细胞系BPH1和三种衍生致癌亚系BPH1（CAFTD）1、BPH1（CAFTD）3和BPH1的影响。数据表明TGF-β对非致瘤细胞和致瘤细胞有不同的作用。TGF-β可抑制非肿瘤原性细胞的生长。相反，致瘤亚系不受生长抑制，而是在TGF-β的作用下进行上皮-间充质转化（EMT）。致瘤细胞系显示磷酸化Akt水平显著升高，通过阻断Smad3和p21核转位调节其对TGF-β的反应。在致瘤亚系的TGF-β刺激下，激活的Akt允许细胞逃避细胞周期阻滞。磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路也参与TGF-β诱导的EMT，此处定义为诱导波形蛋白表达和增强细胞运动。体内，具有组成活性TGF-β信号的致瘤细胞显示EMT的侵袭性增加，EMT表达波形蛋白，具体位于肿瘤的侵袭前沿。这些数据表明，恶性转化后TGF-β可在促进前列腺癌发生方面发挥直接作用，并且这些反应在体内具有环境特异性。

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图1
非致瘤细胞和衍生致瘤细胞对TGF-ß1表现出不同的反应。一个、BPH1和BPH1的生长反应^{加拿大食品药品监督管理局}1 (*CAFTD1型*)，BPH1^{加拿大食品药品监督管理局}3 (*CAFTD3*)和BPH1^CAFTD公司5 (*CAFTD5型*)细胞至5 ng/mL TGF-ß1。TGF-ß抑制非肿瘤原性双亲BPH1细胞的生长。相反，在TGF-ß的作用下，致瘤亚系的增殖没有明显变化。B类、BPH1和BPH1的表型反应^CAFTD公司1、BPH1^CAFTD公司3和BPH1^CAFTD公司用5 ng/mL TGF-ß1处理5个细胞至72小时。相控显微照片显示，对TGF-ß的反应，BPH1细胞形状没有改变。相反，三条CAFTD线表现出不同程度的伸长。免疫荧光染色显示蛋白质表达的变化。广谱细胞角蛋白显示为红色，波形蛋白显示为绿色。用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚将核DNA染成蓝色。在无血清培养基中，所有四种细胞系都表达细胞角蛋白，几乎没有检测到波形蛋白。TGF-ß1治疗后，致瘤细胞（而非非致瘤亲代细胞）启动波形蛋白的表达并失去角蛋白的表达。C类，Western blotting证实了免疫荧光数据。作为对5 ng/mL TGF-ß1治疗的反应，治疗72小时后在致瘤BPH1中诱导波形蛋白表达^CAFTD公司1、BPH1^CAFTD公司3和BPH1^CAFTD公司5个细胞，而E-cadherin和角蛋白的表达在这些致瘤细胞中受到抑制。在非肿瘤原性双亲BPH1细胞中，波形蛋白或角蛋白的表达没有同等变化。

图2
磷酸化Akt阻断Smad3在人前列腺上皮细胞中转移到细胞核。一个，将细胞与5ng/mL TGF-ß1孵育4小时，并进行处理以产生细胞质(C类)和核能(N个)提取物。使用组蛋白H1和ß-肌动蛋白作为细胞核和细胞质标记物以及负载对照来确认特异性。Smad3定位分析表明，在非肿瘤性BPH1细胞中，TGF-ß1治疗后Smad3主要定位于细胞核。相反，在BPH1中^CAFTD公司1细胞，Smad3在细胞核和细胞质组分中的水平相似。myrAkt1在BPH1细胞中的过度表达(*BPH1-节*)抑制Smad3向细胞核的移位，而使用PI3K抑制剂10μmol/L Ly294002进行治疗(第页)或100 nmol/L沃特曼(*WM公司*)使Smad3易位到BPH1的细胞核^CAFTD公司1.Smad2的总定位和磷酸化定位在Akt激活后没有明显变化。B类免疫荧光染色显示Smad3在有或无TGF-ß1治疗的细胞中的定位。Smad3显示为绿色，而细胞核用PI染色并显示为红色。未经处理，Smad3定位于BPH1和BPH1的细胞质中^CAFTD公司1个单元格。TGF-ß处理后，几乎所有Smad3都转移到BPH1细胞的细胞核中；然而，在BPH1中^CAFTD公司1个细胞，核质定位。沃特曼预处理增强Smad3在BPH1中的核定位^CAFTD公司1个单元格。C类使用NIH ImageJ软件定量Smad3易位。在五个随机场中逐个细胞测量位于细胞核或整个细胞体内的平均光子。绘制细胞核染色比例。TGF-ß1处理的BPH1细胞显示出更多的核Smad3（前处理为25%，后处理为71%；*P（P）*<0.01），但BPH1^CAFTD公司1对TGF-ß1无明显Smad3重定位反应（核染色比例分别为21%和24%；*P（P）*> 0.05). Wortmann预处理使Smad3在TGF-ß1上的核分布比例增加到61%(*P（P）*< 0.01).

图3
磷酸化Akt可以减少细胞核p21并导致G的释放₁-TGF-ß被捕。一个BPH1和BPH1^CAFTD公司1个细胞用TGF-ß1处理4小时。提取细胞质和细胞核部分。Western blotting结果显示，在BPH1细胞中，p21定位于胞浆和核部分。在BPH1中^CAFTD公司1个细胞，仅可见胞质p21。在BPH1细胞中过度表达myrAkt1可显著降低细胞核部分的p21水平，而沃特曼治疗可维持BPH1细胞核p21水平^CAFTD公司1个单元格。免疫荧光染色证实p21的分布模式。B类和C类流式细胞术分析显示，TGF-ß1治疗4小时后，BPH1细胞在G₁-S相(B类)，而BPH1^CAFTD公司1个单元格(C类)跳过了细胞周期检查。

图4
PI3K/Akt通过TGF-ß信号传导参与波形蛋白诱导。一个BPH1和BPH1的免疫荧光染色^CAFTD公司1个细胞表达空载体(*电动汽车*)，日期ßRI(*陆军部*)，myrAkt1(*阿克特*)和Smad3(*第3章*)逆转录病毒结构。对细胞进行染色，以显示波形蛋白、角蛋白和E-cadherin的表达。在非肿瘤原性BPH1细胞中，在所有条件下都保持鹅卵石上皮表型，E-cadherin和细胞角蛋白的表达保持不变，对波形蛋白抗体几乎没有免疫反应。相反，致瘤性BPH1^CAFTD公司当显性活性受体或myrAkt1表达时，1细胞显示波形蛋白诱导和抑制E-cadherin。值得注意的是，在这些致瘤细胞中刺激Smad通路并不会引起与EMT一致的表型变化。B类Western blot分析证实了免疫细胞化学观察结果，在任何情况下，BPH1细胞都没有波形蛋白表达，而BPH1^CAFTD公司当显性活性受体或myrAkt1表达时，1个细胞显示波形蛋白表达显著增加。正常人前列腺成纤维细胞(*净现值*)用作阳性对照C类，桶/小时1^CAFTD公司将1个细胞的血清饥饿过夜，并在存在或不存在PI3K抑制剂沃特曼（100 nmol/L）的情况下用TGF-ß1（5 ng/mL）处理60小时。用波形蛋白抗体探测细胞裂解物。在用沃特曼预处理后，TGF-ß对波形蛋白的诱导作用受到损害。在一项平行研究中，BPH1^CAFTD公司在TGF-ß1治疗前24小时，1个细胞被DN-Akt腺病毒感染。结果表明，DN-Akt感染后，TGF-ß不会诱导这些细胞中的波形蛋白表达。使用磷酸化GSK3ß来确认Akt的激酶失活。ß-Actin被用作加载控制。

图5
TGF-ß或Akt信号的激活可增强细胞运动。一个在伤口愈合试验中，BPH1速度的测量^CAFTD公司封闭伤口的1个细胞显示，与空载体相比，DATßRI和myrAkt1都增强了细胞的迁移率，而Smad3的表达没有影响。所有实验均一式三份。柱，平均值；酒吧，SD。*P（P）*<0.01（学生的t吨测试）。B类Transwell迁移试验显示出与创伤愈合试验类似的效果，DATßRI和myrAkt1均显著增强血清存在时的侵袭性，而Smad3过度表达则无显著抑制作用。所有实验均一式三份。柱，平均值；酒吧，SD。*P（P）*<0.01（学生的t吨测试）。

图6
TGF-ß刺激细胞侵袭体内.BPH1的移植^{加拿大食品药品监督管理局}1个携带空载体控制的细胞(*A、 C类*、和E类)或DATßRI(*B、 D类*、和F类). 细胞移植到SCID小鼠的肾包膜上，2个月后收获。切片进行SV40T抗原表达染色(一个和B类)或SV40T抗原双重染色(红色)和波形蛋白(绿色)使用免疫荧光(*立方英尺*). 双酚H1^CAFTD公司在空载体对照组中，观察到1个细胞具有微创性，因此选择了1个细胞进行此分析(*A、 C类*、和E类). 这些肿瘤生长在肾脏表面，侵袭力有限，没有波形蛋白表达。相反，表达DATßRI的细胞侵入宿主肾脏，浸润肾小管之间和周围(*B、 D类*、和F类). 上皮细胞的波形蛋白表达特异性地定位在侵袭前沿，而不是肿瘤体内(D类和F类). 波形蛋白和SV40T的共表达（详见F类)证实表达波形蛋白的细胞来源于BPH1^CAFTD公司1行。

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