Striatin assembles a membrane signaling complex necessary for rapid, nongenomic activation of endothelial NO synthase by estrogen receptor alpha

doi:10.1073/pnas.0407492101

.2004年12月7日；101(49):17126-31.

doi:10.1073/pnas.0407492101。 Epub 2004年11月29日。

Striatin组装雌激素受体α快速非基因激活内皮一氧化氮合酶所必需的膜信号复合物

青露¹, 大卫·C·帕拉斯, 霍华德·科瑟克斯, 温迪·鲍尔, 迈克尔·E·门德尔松, 理查德·卡拉斯

附属公司

PMID： 15569929
预防性维修识别码： PMC534607型
内政部： 10.1073/pnas.0407492101

Striatin组装雌激素受体α快速非基因激活内皮一氧化氮合酶所必需的膜信号复合物

青露等。美国国家科学院程序. 2004.

.2004年12月7日；101(49):17126-31.

doi:10.1073/pnas.0407492101。 Epub 2004年11月29日。

作者

青露¹, 大卫·C·帕拉斯, 霍华德·科瑟克斯, 温迪·鲍尔, 迈克尔·门德尔松, 理查德·卡拉斯

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨新英格兰医学中心医学部分子心脏病学研究所，邮编02111。

PMID： 15569929
预防性维修识别码： PMC534607型
内政部： 10.1073/pnas.0407492101

摘要

类固醇激素受体（SHR）是配体激活的转录因子，调节基因表达。SHR也通过类固醇介导快速的非基因组细胞活化。在血管内皮细胞中，雌激素的SHR，即雌激素受体（ER）α，通过未知机制靶向膜小泡中的功能信号模块，使雌激素能够快速激活有丝分裂原激活的蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-Akt激酶途径以及内皮一氧化氮合酶（eNOS）。在此，我们确定110-kDa小窝蛋白结合蛋白纹状体作为将ERalpha定位于膜并组织ERalpha-eNOS膜信号复合物的分子锚定。Striatin直接与ERalpha的183-253氨基酸结合，靶向细胞膜，并作为ERalpha-Galphai复合物形成的支架。ERalpha和纹状体蛋白之间复合物形成的中断阻断了雌激素诱导的快速激活丝裂原活化蛋白激酶、Akt激酶和eNOS，但对雌激素反应元件驱动的报告质粒的ER-依赖性调节没有影响。这些发现确定纹状体是一种分子支架，需要快速、非基因雌激素介导下游信号通路的激活。此外，通过证明非基因组与基因组ER依赖信号的独立调节，这些发现为潜在开发“路径特异性”选择性ER调节剂提供了概念支持。

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数字

**图1。**
ERα通过ER的183–253氨基酸直接与纹状体结合(A类)纹状体相关结构域示意图。(B类)纹状体与ERα共同免疫沉淀在多种细胞中，包括内源性表达ERα的细胞[EAhy926细胞（人内皮细胞系）、MCF7细胞（人乳腺癌细胞系）和GH3B6细胞（大鼠垂体细胞系）]和转染ERα表达质粒的ERα阴性细胞[Rad91细胞（人桡动脉衍生血管平滑肌细胞系）]。免疫沉淀ERα；NI，非免疫沉淀；五十、总细胞裂解物的分数。(C)短期E2处理增强ERα和纹状体蛋白之间的复合物形成。ERα从转染ERα的Rad91细胞中免疫沉淀，无论是否暴露于10^–8M E2持续20分钟(天)Striatin直接结合ERα。GST融合蛋白与转染ERα的Rad91细胞的裂解物孵育(左侧)或使用重组ERα(赖特). (E类)Striatin与ERα的183–253氨基酸结合。(上部)GST下拉实验中使用的ERα片段示意图。(下部)含有全长ERα或ERα片段的GST融合蛋白与Cos1细胞裂解物孵育。

**图4。**
纹状体-ERα结合的中断阻止E2诱导的非基因组信号传导，但不阻止基因组信号传导。(A类)由纹状体结合域组成的肽在ERα、ER中的过度表达_176–253，防止ERα和纹状体蛋白之间形成复合物。(B类)阻断肽ER的过度表达_176–253不干扰E2对ERα的转录激活。将ERα表达质粒和雌激素反应元件驱动的荧光素酶报告质粒瞬时转染Cos1细胞，质粒编码ER_176–253或空向量。细胞单独用载体处理（开条）或10^–8M E2（填充钢筋）。在雌激素受体存在的情况下，E2诱导的雌激素受体α活化程度稍高_176–253条形图表示四个独立实验的平均值±SE。*,*P（P）*<0.05 vs.空向量。(C)ER过度表达_176–253阻断E2诱导的MAPK磷酸化增加。转染ERα和对照载体或ERα和ER的Cos1细胞的裂解物_176–253用E2治疗不同时间后，免疫印迹检测磷酸化MAPK（pMAPK）或总MAPK。条形图显示了四个独立实验的平均值±SE。*,*P（P）*< 0.01;**,*P（P）*与时间0相比<0.05。(天)阻断肽ER的过度表达_176–271防止E2诱导的Akt激酶磷酸化。用Tat-GFP孵育表达内源性ERα的EAhy926细胞(○) 或Tat-ER_176–253(▪) E2治疗前6小时。然后对总蛋白裂解物进行免疫印迹，以检测磷酸化AKT（pAKT），并将其归一化为总AKT的量。这些比率被归一化为车辆处理细胞的比率。结果表示四个独立实验得出的平均值±SE。*,*P（P）*<0.05 vs.时间0。(E类)阻断肽ER的过度表达_176–253防止E2诱导的eNOS磷酸化。EAhy926与Tat-GFP孵育(○) 或Tat-ER_176–253(▪) E2治疗前6小时。然后对总蛋白裂解物进行免疫印迹，以检测磷酸化eNOS（peNOS），并将其归一化为总eNOS的量。这些比率被归一化为车辆处理细胞的比率。结果表示四个独立实验得出的平均值±SE。*,*P（P）*<0.05 vs.时间0。

**图2。**
Striatin将ERα靶向质膜。(A类–C)对没有纹状体蛋白过度表达的EAhy926细胞进行ERα免疫染色(A类)或纹状体(B类)，图像已合并(C). 在这些条件下，只检测到少量膜相关ERα。(天–我)用纹状体表达质粒转染的EAhy926细胞对ERα进行免疫染色(A类和天)，纹状体(B类,E类、和*H（H）*)，或eNOS(克)，图像已合并(C,F类、和我). 在这些条件下，检测到大量膜相关ERα，其与纹状体蛋白和eNOS共定位。(J型)纹状体蛋白的过度表达增加了膜组分中可检测到的ERα的比例。通过差速离心分离转染控制载体（–）或纹状体表达质粒（+）的EAhy926细胞的裂解液。通过免疫印迹主要针对膜蛋白[EGFR和IGFR（数据未显示）]或核蛋白组蛋白来鉴定质膜和核级分的纯度。

**图3。**
Striatin组装包含ERα和Gαi的复合物。(A类)E2诱导Gαi与纹状体素和ERα复合，并通过与PTX或ER拮抗剂ICI 182780（ICI）共培养而阻断。免疫印迹法显示Gαi的等效回收率（数据未显示）。SFM，无血清培养基。(B类)PTX消除E2诱导的MAPK磷酸化。*,*P（P）*与SFM相比<0.05。n个=3个独立实验。(C)Gαi不直接与ERα结合。(天)Gαi与纹状体蛋白的C末端结合。含有全长纹状体或纹状体N末端（纹状体蛋白）的GST融合蛋白_1–203)与转染Gαi的Cos1细胞的裂解物孵育。(E类)ERα和Gαi之间的复合物形成需要条纹。GST或GST–Gαi融合蛋白与重组（rER）在无纯化全长纹状体或纹状体蛋白的情况下孵育_1–203.rERα，重组ERα。(F类)条纹与eNOS形成复合物。通过GST融合下拉框中的免疫印迹和EAhy926细胞裂解物的共免疫沉淀鉴定eNOS。

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1. Chambliss，K.L.、Yuhanna，I.S.、Anderson，R.G.、Mendelsohn，M.E.和Shaul，P.W.（2002）《分子内分泌》。第16页，938–946页。-公共医学
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