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.2003年8月；23(15):5331-45.
doi:10.1128/MCB.23.15.5331-5345.2003。

RNF5，一种环指蛋白，通过靶向帕西林泛素化和改变定位来调节细胞运动

克里斯汀·迪迪埃 1, 利莫·布罗迪, 安妮迪塔·博米克, 沙龙以色列, 高桥秀一, 中山浩, 希拉·M·托马斯, 克里斯托弗·特纳, 斯科特·亨德森, Hisataka Sabe公司, 泽埃夫·罗奈
附属公司

RNF5，一种环指蛋白，通过靶向帕西林泛素化和改变定位来调节细胞运动

克里斯汀·迪迪尔等。 分子细胞生物学. 2003年8月.

摘要

RNF5是一种环指蛋白，在秀丽隐杆线虫的生长发育中起重要作用。通过酵母双杂交筛选对RNF5相关蛋白的搜索，在秀丽线虫中鉴定出一种含有LIM的蛋白，该蛋白与人类paxillin具有同源性。在这里，我们证明RNF5的人类同源物与帕西林的氨基末端结构域相关，导致其泛素化。RNF5需要完整的RING和C末端结构域来介导蛋白泛素化。鉴于RNF5在体内能有效地介导paxillin的泛素化，体外泛素化需要蛋白质提取物，这表明额外的修饰和/或相关的E3连接酶有助于RNF5靶向paxilin泛素化。突变体Ubc13有效抑制RNF5泛素化，表明RNF5产生K63拓扑的多链泛素。RNF5的表达增加了paxillin的细胞质分布，同时减少了其在局灶性粘连中的定位，主要在正常生长时可见。同时，RNF5表达导致细胞运动抑制。通过靶向帕西林泛素化改变其定位，RNF5成为一种新的细胞运动调节因子。

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数字

图1。
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对齐秀丽线虫和人类RNF5。（A） 人类（Hs）和秀丽线虫RNF5的（Ce）形式对齐。RNF5中的重要结构域带有下划线（RING、中心和羧基末端结构域）。（B） 对齐秀丽线虫含LIM的蛋白质Y105E8a.6和人帕西林。这两种蛋白质在LIM结构域（paxillin的LIM1和LIM4中最高；装箱区）以及paxillin的LD4和LD5结构域之间的区域中发现了同源性。
图2。
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RNF5与帕西林的相关性。（A）秀丽线虫RNF5与帕西林相关。标记的标志秀丽线虫RNF5（F-铈RNF5），一种缺乏17个氨基酸的剪接变体，以及RING突变C26A形式被转染到293T细胞中，24小时后，如图所示，对细胞进行诺可唑（100 ng/ml）处理或模拟处理。18小时后制备蛋白质并进行免疫沉淀（IP）带有内源性帕西林抗体。免疫沉淀物质通过Western blots（IB）和图中所示的抗体进行分析。箭头指向相应的蛋白质。空箭头指向RNF5的单泛素和双泛素形式。（B） 人RNF5（hRNF5）与帕西林结合。将标记的人类RNF5（F-hRNF5）转染到293T细胞中，这些细胞经过模拟或诺卡唑处理。蛋白质（1 mg）在用图中所示抗体进行Western blot分析后，用巴西林抗体进行免疫沉淀。（C）RNF5的突变形式比野生型RNF5与巴西林的结合更强。RNF5的标记形式（人类野生型、环突变体和C末端缺失[ΔC-ter]形式和秀丽线虫RNF5）转染293T细胞；24小时后，制备蛋白质并用帕西林抗体进行免疫沉淀，然后用图中所示抗体进行免疫印迹分析。与B组相比，ECL反应的相对强度降低，以强调帕罗西林与不同形式RNF5结合的差异。显示了用长春花蛋白抗体和对照IgG进行免疫沉淀的对照反应，随后用Flag-RNF5进行免疫印迹。RNF5表格的表达式（输入）显示在右侧面板上。（D） RNF5和帕西林的体内联合。用抗RNF5的单克隆抗体免疫沉淀内源性人RNF5，然后用图中所示的抗体进行免疫印迹分析。NS，非特异性。（E） RNF5通过氨基末端结构域与帕西林结合。在293T细胞中，含有LIM或氨基末端结构域的表达载体与RNF5共表达。用所示抗体进行免疫沉淀，确定与缺乏LIM结构域（ΔLIM1-4）且仅包含氨基末端结构域的帕西林相关。（F） 帕罗西汀和RNF5之间的体外关联。GST-RNF5（人类野生型和RING突变型和秀丽线虫野生型和Δ17ΔRING形式）融合蛋白与35S-标记的paxillin，GST-paxilin与35标有S的RNF5。所示的结合物质数量反映了直接关联，随后发生了广泛的高盐洗脱。
图2。
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RNF5与帕西林的相关性。（A）秀丽线虫RNF5与帕西林相关。标记的标志秀丽线虫RNF5（F-铈RNF5），一种缺乏17个氨基酸的剪接变体，以及RING突变C26A形式被转染到293T细胞中，24小时后，如图所示，对细胞进行诺可唑（100 ng/ml）处理或模拟处理。18小时后制备蛋白质并进行免疫沉淀（IP）带有内源性帕西林抗体。免疫沉淀物质通过Western blots（IB）和图中所示的抗体进行分析。箭头指向相应的蛋白质。空箭头指向RNF5的单泛素和双泛素形式。（B） 人RNF5（hRNF5）与帕西林结合。将标记的人类RNF5（F-hRNF5）转染到293T细胞中，这些细胞经过模拟或诺卡唑处理。蛋白质（1 mg）在用图中所示抗体进行Western blot分析后，用巴西林抗体进行免疫沉淀。（C）RNF5的突变形式比野生型RNF5与巴西林的结合更强。RNF5的标记形式（人类野生型、环突变体和C末端缺失[ΔC-ter]形式和秀丽线虫RNF5）转染293T细胞；24小时后，制备蛋白质并用帕西林抗体进行免疫沉淀，然后用图中所示抗体进行免疫印迹分析。与B组相比，ECL反应的相对强度降低，以强调帕罗西林与不同形式RNF5结合的差异。文中显示了使用小病毒抗体的控制反应和免疫沉淀的控制IgG，然后使用Flag-RNF5进行免疫印迹。RNF5表格的表达式（输入）显示在右侧面板上。（D） RNF5和帕西林的体内联合。用抗RNF5的单克隆抗体免疫沉淀内源性人RNF5，然后用图中所示的抗体进行免疫印迹分析。NS，非特异性。（E） RNF5通过氨基末端结构域与帕西林结合。将含有LIM或氨基末端结构域的表达载体与RNF5在293T细胞中共表达。用所示抗体进行免疫沉淀，确定与缺乏LIM结构域（ΔLIM1-4）且仅包含氨基末端结构域的帕西林相关。（F） 帕西林与RNF5的体外相关性。GST-RNF5（人类野生型和RING突变型和秀丽线虫野生型和Δ17ΔRING形式）融合蛋白与35S-标记的paxillin，GST-paxilin与35标有S的RNF5。所显示的结合材料的量反映了随后进行大量高盐洗涤的直接缔合。
图3。
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RNF5 E3连接酶活性和帕西林的体外泛素化。（A） E3连接酶活性秀丽线虫体外RNF5。用细菌表达和纯化的GST与全长或Δ17C26（A）（RING结构域内的17个氨基酸突变）融合进行体外泛素化测定秀丽线虫RNF5.E1、E2（UbcH5c）的纯化形式，以及细菌产生的32在ATP存在的情况下添加P标记的泛素（Ub）。结合在谷胱甘肽珠上的GST-RNF5在SDS-PAGE分离之前进行清洗，并通过放射自显影术进行分析。指出了单泛素和双泛素的位置。下面的面板描绘了考马斯蓝染色，反映了用于反应的蛋白质数量。（B） 体外人RNF5的E3连接酶活性。除使用野生型和环突变体RNF5的人类形式外，体外泛素化反应如上文所示进行。如图所示，在添加E1、E2、，32P-泛素和泛素化缓冲液。箭头指向单、双和多泛素形式的位置。下面的面板描绘了考马斯蓝染色，反映了用于反应的蛋白质数量。（C） RNF5在体外介导帕西林的泛素化。用细菌表达和纯化的GST-hRNF5（野生型或RING突变型）和35在E1和E2存在的情况下，在体外翻译的帕西林中标记S-，持续指定时间。反应后，旋转GST-hRNF5，并将上清液[35S] 用SDS-PAGE对帕西林进行分离。所示为泛素化帕西林的放射自显影。下部面板显示GST-hRNF5（左侧面板）或GST（右侧面板）的输入。
图4。
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RNF5在体内泛素化帕西林而不影响其半衰期。（A） RNF5促进体内巴西林泛素化。将野生型（WT）和突变形式的RNF5（RING突变和C-末端缺失）与HA标记的泛素共转染到293T细胞中。转染24小时后制备蛋白质并进行免疫沉淀，然后用图中所示的抗体进行免疫印迹分析。在侧面板上标记尺寸和多泛素链。RNF5输入的蛋白质印迹分析显示在底部面板上。β-肌动蛋白印迹用于确保均匀加载。（B） 体内RNF5 E3连接酶依赖于Ubc13。将野生型和突变型人类RNF5与HA-ubiquitin和野生型或突变型Ubc13共同转染到293T细胞中。在变性条件下制备的蛋白质用标记的RNF5抗体进行免疫沉淀，然后用图中所示的抗体进行免疫印迹。下面板显示Ubc13的表达。（C） RNF5不影响帕罗西汀在体外的半衰期。用体外翻译法监测帕西林的半衰期35S标记的帕西林。在其翻译后，如图所示，对巴西林进行免疫沉淀并与E1、E2和RNF5孵育。RNF5也与模拟处理（+）和诺卡唑处理（*）细胞的蛋白提取物孵育，以实现翻译后修饰，从而提高与巴西林的结合和泛素化效率。
图5：。
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内源性和外源性表达的RNF5的细胞定位。（A） 内源性RNF5的细胞定位。用RNF5单克隆抗体对NIH 3T3（a）或HeLa（b）细胞进行基于免疫细胞化学的共聚焦显微镜分析。4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色显示在左侧面板中。比例尺。10微米。（B） 外源性表达RNF5的细胞定位。用标记的野生型（a）、环突变体（b）和C末端缺失型（C）RNF5转染NIH 3T3细胞；30小时后，用Flag抗体对细胞进行共聚焦显微镜免疫细胞化学分析。左侧面板显示DAPI染色。图片表示独立实验的多个场。
图6。
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RNF5表达影响帕西林的细胞分布。（A） RNF5改变帕西林定位。在RNF5转染细胞中监测内源性帕西林的定位。图a显示内源性帕西林染色。注意表达RNF5的细胞（面板b至d）与不表达RNF5[黄色箭头]的细胞中paxillin定位的差异。该图表示在五个独立实验中观察到的多个字段和数据。黄色箭头指向表达RNF5并显示paxillin定位改变的细胞。比例尺，10μm。（B） RNF5的突变形式不影响帕西林的定位。如图所示，用突变的Flag-RNF5形式（RING突变或C末端缺失形式）转染NIH 3T3细胞。红色荧光识别Flag抗体（RNF5），而绿色荧光识别paxillin抗体。（C） RNF5和长春新碱定位。对转染或未转染RNF5的细胞进行了病毒蛋白分析。红色染色显示RNF5，而绿色显示vinculin表达。
图6。
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RNF5的表达影响帕罗西汀的细胞分布。（A） RNF5改变帕西林定位。在RNF5转染细胞中监测内源性帕西林的定位。图a显示内源性帕西林染色。注意表达RNF5的细胞（面板b至d）与不表达RNF5[黄色箭头]的细胞中paxillin定位的差异。该图表示在五个独立实验中观察到的多个字段和数据。黄色箭头指向表达RNF5并显示paxillin定位改变的细胞。比例尺，10μm。（B） 突变形式的RNF5不影响蛋白的定位。如图所示，用突变的Flag-RNF5形式（RING突变或C末端缺失形式）转染NIH 3T3细胞。红色荧光识别Flag抗体（RNF5），而绿色荧光识别paxillin抗体。（C） RNF5和vinculin定位。对转染或未转染RNF5的细胞进行了病毒蛋白分析。红色染色显示RNF5，而绿色显示vinculin表达。
图6。
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RNF5表达影响帕西林的细胞分布。（A） RNF5改变帕西林定位。在RNF5转染细胞中监测内源性帕西林的定位。图a显示内源性帕西林染色。注意表达RNF5的细胞（面板b至d）与不表达RNF5[黄色箭头]的细胞中paxillin定位的差异。该图表示在五个独立实验中观察到的多个字段和数据。黄色箭头指向表达RNF5并显示paxillin定位改变的细胞。比例尺，10μm。（B） RNF5的突变形式不影响帕西林的定位。如图所示，用突变的Flag-RNF5形式（RING突变或C末端缺失形式）转染NIH 3T3细胞。红色荧光识别Flag抗体（RNF5），而绿色荧光识别paxillin抗体。（C） RNF5和vinculin定位。对转染或未转染RNF5的细胞进行了病毒蛋白分析。红色染色显示RNF5，而绿色显示vinculin表达。
图7。
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RNF5抑制NIH 3T3细胞的迁移。（A） 用图中所示的RNF5结构转染细胞，48小时后对细胞进行伤口试验。用移液管尖端在汇合均匀的细胞中心划痕。在指定的时间点拍摄延时照片，显示细胞填充伤口（间隙）的能力。所示图片代表多重分析。（B） 按照面板A的指示进行实验，但首先用纤维连接蛋白（10μg/ml）涂敷板除外。（C） ●●●●。RNF5对无桩蛋白细胞中细胞运动的影响。用图中所示的结构对帕金森阴性细胞进行转染，并进行时间推移分析，以监测上述细胞迁移的变化。
图7。
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RNF5抑制NIH 3T3细胞的迁移。（A） 用图中所示的RNF5结构转染细胞，48小时后对细胞进行伤口试验。用移液管尖端，在同样融合的细胞中心产生划痕。在指定的时间点拍摄延时照片，显示细胞填充伤口（间隙）的能力。所示图片代表多重分析。（B） 按照面板A的指示进行实验，但首先用纤维连接蛋白（10μg/ml）涂敷板除外。（C） ●●●●。RNF5对paxillin-null细胞运动的影响。用图中所示的结构对帕金森阴性细胞进行转染，并进行时间推移分析，以监测上述细胞迁移的变化。
图7。
图7。
RNF5抑制NIH 3T3细胞的迁移。（A） 用图中所示的RNF5结构转染细胞，48小时后对细胞进行伤口试验。用移液管尖端在汇合均匀的细胞中心划痕。在指定的时间点拍摄延时照片，显示细胞填充伤口（间隙）的能力。所示图片代表多重分析。（B） 按照面板A的指示进行实验，但首先用纤维连接蛋白（10μg/ml）涂敷板除外。（C） ●●●●。RNF5对paxillin-null细胞运动的影响。用图中所示的结构对帕金森阴性细胞进行转染，并进行时间推移分析，以监测上述细胞迁移的变化。
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