Activation of yeast Snf1 and mammalian AMP-activated protein kinase by upstream kinases

doi:10.1073/pnas.1533136100

.2003年7月22日；100(15):8839-43.

doi:10.1073/pnas.1533136100。 Epub 2003年7月7日。

上游激酶激活酵母Snf1和哺乳动物AMP活化蛋白激酶

Seung-Pyo Hong先生¹, 菲奥娜·莱珀, 安吉拉·伍兹, 戴维·卡林, 玛丽安·卡尔森

附属公司

PMID： 12847291
预防性维修识别码：项目经理166400
内政部： 10.1073/pnas.1533136100

上游激酶激活酵母Snf1和哺乳动物AMP活化蛋白激酶

Seung-Pyo Hong先生等人。美国国家科学院程序. 2003.

.2003年7月22日；100(15):8839-43.

doi:10.1073/pnas.1533136100。 Epub 2003年7月7日。

作者

Seung-Pyo Hong先生¹, 菲奥娜·莱珀, 安吉拉·伍兹, 戴维·卡林, 玛丽安·卡尔森

附属

¹哥伦比亚大学遗传与发展系，美国纽约州纽约市10032。

PMID： 12847291
预防性维修识别码：项目经理166400
内政部： 2017年10月10日/第133136100页

摘要

真核生物中Snf1/AMP-activated protein kinase（AMPK）家族在细胞对代谢应激的反应中起着重要作用。在人类中，AMPK调节脂质和葡萄糖代谢，并与糖尿病、肥胖和心脏异常等代谢紊乱有关。Snf1和AMPK是激酶级联的下游成分，但上游激酶仍然难以捉摸。我们在这里鉴定了三种酵母激酶，Pak1p、Tos3p和Elm1p，它们在体内激活Snf1激酶。同源基因的三重缺失导致Snf突变表型，并取消Snf1催化活性。所有三种激酶磷酸化苏氨酸活化的重组Snf1p。此外，Tos3p在等效残基上磷酸化哺乳动物AMPK并激活该酶，这表明酵母和哺乳动物之间上游激酶的功能守恒。我们进一步证明，与Peutz-Jeghers癌易感综合征相关的密切相关的哺乳动物LKB1激酶在体外磷酸化并激活AMPK。因此，酵母上游激酶的鉴定应有助于鉴定相应的、生理上重要的哺乳动物上游激酶。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
过度表达和突变表型。(A类)Tos3p过度表达，在报告分析中，Pak1p和Elm1p刺激Snf1功能。转化体酵母菌株（TAT7）携带*lexAop-lacZ*记者表示来自铜诱导启动子的GST或GST-Tos3p、-Pak1p或-Elm1p（pOV85，pRH95、pRH98和pRH94）和LexA-Snf1p（pOV8；参考。37). 合成β-半乳糖苷酶依赖于LexA-Snf1p的催化活性(36). 转化体(n个=3）在选择性SC和2%葡萄糖中生长到中对数期，转移到含有0.5 mM CuSO的介质₄在2%的条件下葡萄糖（开放棒）或0.05%葡萄糖（填充棒）3小时，并对β-半乳糖苷酶活性(36). 控制变形金刚用每个GST-激酶表达LexA的值小于0.3个单位。(B类)三倍到3Δ*乘客1*Δ*elm1级*Δ突变体表现出生长缺陷。这个到3Δ*乘客1*Δ和到3Δ*elm1级*Δ::*URA3型*双突变体（两者运送*尿酸3*)进行杂交并进行四分体分析。将分离物从富培养基复制到SC-Ura加2%葡萄糖和SC加上2%甘油/3%乙醇。图中显示了五个四分体。相同的模式在SC加含2%棉籽糖的抗霉素A（1）上观察到生长μg/ml）。星号表示三个突变分离子。对照菌株：WT，*snf1*Δ突变体和双亲突变体。

**图2。**
Snf1激酶活性的测定。(A类和B类)WT和三重表达LexA-Snf1p或其T210A和K84R突变衍生物的突变细胞【pRJ55、pRJ217和pRJ215（16） ]选择性生长SC加2%葡萄糖。从提取物（200μg）中免疫沉淀蛋白质使用反LexA。(A类)免疫沉淀物在激酶中孵育含有[γ]的缓冲液-³²P] ATP并通过SDS/PAGE和放射自显影术。(B类)免疫沉淀物的分析方法为抗LexA免疫印迹。(C类)测定Snf1激酶活性通过测定SAMS肽的磷酸化(8,30). A类*snf1-K84R型*突变体提取物也没有活性。(D类)分析的部分用抗Snf1进行免疫印迹。

**图3。**
T210上的Tos3p、Pak1p和Elm1p磷酸化Snf1p在体外.GST-Tos3p（31），-Pak1p（31）和-Elm1p（32）从酵母中纯化细胞。固定在小球上的GST激酶与细菌孵育表达Snf1KD-K84R或-T210A（0.2μg），或无底物[γ]的-³²P] ATP在25°C下持续20分钟。分析了蛋白质SDS/PAGE和放射自显影。显示自动射线图。一个武断的GST激酶YPL141C作为对照。箭头，突变体Snf1KD；星号，自动磷酸化全长GST激酶。分子质量标记（kDa）表示。

**图4。**
Tos3p和LKB1磷酸化并激活AMPK在里面体外.(A类)细菌表达的AMPK（34）与MgATP孵育和固定化GST激酶（由pRH95、pRH98和pRH94表达），以及AMPK使用SAMS肽分析测定活性（30）。(B类)A类催化失活突变AMPK（D157A替代）与GST-Tos3p或GST与谷胱甘肽-脑葡萄糖珠结合[γ-³²P] ATP和蛋白质通过SDS/PAGE和放射自显影术。显示了分子质量标记（kDa）。(C类)将细菌表达的AMPK（0.15μg）与GST-Tos3p、GST或部分纯化大鼠肝脏AMPKK（21）并由分析用磷苏氨酸172特异性抗体进行免疫印迹。(D类和E类)纯化、固定化标记有FLAG的LKB1，WT或催化失活突变体（D194A）与细菌培养表达了AMPK。空载体是pCDNA3（Invitrogen），缺少LKB1插入。(D类)测定AMPK活性(30). (E类)T172的磷酸化通过免疫印迹法测定，如C类.

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