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.2001年1月；21(1):88-99.
doi:10.1128/MCB.21.1.88-99.2001。

细胞周期素依赖性激酶2和7的相互激活由T环外的底物特异性决定簇决定

S加勒特 1, 瓦巴顿, R骑士, P Jin先生, D O摩根, R P费希尔
附属公司

细胞周期素依赖性激酶2和7的相互激活由T环外的底物特异性决定簇决定

S加勒特等。 摩尔细胞生物学. 2001年1月.

摘要

细胞周期素依赖性激酶7（CDK7）是后生动物CDK活化激酶（CAK）的催化亚单位，通过T环中保守苏氨酸残基的磷酸化激活CDK，如CDC2和CDK2。CDK7的完全激活需要与一个正调控亚单位cyclin H结合，并在其自身T环的170位磷酸化保守苏氨酸残基。我们发现CDK7的苏氨酸-170在体外被其靶点CDC2和CDK2磷酸化，CDK7 T环中的丝氨酸-164也磷酸化，该位点与它们的一致磷酸化位点完全匹配。相反，CDK4和CDK7本身在体外都不能磷酸化CDK7 T环。CDC2或CDK2和CDK7相互磷酸化而非自身磷酸化的能力意味着每个激酶可以区分密切相关的序列，并可以识别与其通常首选位点不同的底物位点。为了理解这种反常的底物特异性的基础，我们构建了一种嵌合CDK，将CDK7的T环嫁接到CDK2的体内。令人惊讶的是，杂交酶CDK2-7被CDK7以依赖细胞周期蛋白A的方式有效激活，但完全没有被CDK2激活。此外，CDK2-7磷酸化了野生型CDK7，但没有磷酸化CDK2。我们的结果表明，T环的一级氨基酸序列在确定依赖细胞周期的CAK对其CDK底物的特异性方面仅起到次要作用（如果有的话），并且涉及T环外序列的蛋白质相互作用可以积极和消极地影响底物特异性。

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数字

图1
图1
CDK T环序列的对齐。通过排列DFG和APE基序（下划线）来比较五种哺乳动物CDK的激活片段或T环序列，DFG和APE基序在蛋白激酶中是保守的（15）。磷酸化位点以粗体显示，包括所有五个T环（CDK7中的T170）中存在的激活苏氨酸残基，以及CDC2/CDK2磷酸化位点丝氨酸-164，这是CDK7特有的。
图2
图2
体外CDK7的磷酸化和活化。（A） CDK2-cyclin A（1到3道）和CDC2-cyclin B（4到6道）复合物是通过在体外混合纯亚基而形成的，并通过与固定在蛋白A-Sepharose上的HA标记的CDK7-cyclin H孵育而激活。在不含1μg纯细菌cyclin H-His（在不含CDK7的第2和第5通道中培养）的情况下（第1和第4通道）或存在（第3和第6通道），使用每种100-ng的等分试样磷酸化1μg的纯CDK7。左边的箭头表示CDK7和cyclin H-His的活动性。从凝胶中去除带，并通过液体闪烁计数定量掺入；在没有细胞周期蛋白H的情况下，活化的CDC2每mol CDK7蛋白转移约1.5 mol磷酸盐（数据未显示）。（B） 纯CDK7（1μg），无论是野生型还是无催化活性的K41A突变体，都能被纯CDC2-cyclin B有效磷酸化（通道2-4和9-11），但不能被纯CDK4-cyclin D（通道5-7和12-14）磷酸化。CDC2和CDK4都能有效磷酸化GST-视网膜母细胞瘤蛋白底物（数据未显示）。
图3
图3
CDK7磷酸化状态和激活激酶的细胞周期分析。（A） CDK7的T环磷酸化增加了其电泳迁移率。将含有～1μg HA标记的野生型CDK7（wt；1号和2号道）、CDK 7（S164A）（3号和4号道），CDK7、T170A（5号和6号道）或CDK7的昆虫细胞裂解物（S164A/T170A）（7号和8号道）在没有（奇数道）或（偶数道）100 ng活性CDK2-cyclin A的情况下在1 mM ATP的存在下进行培养。蛋白质变性并在含有交联剂PDA的凝胶中进行SDS-PAGE，然后转移到硝化纤维素膜上。用HA表位特异性MAb 16B12免疫印迹法检测CDK7。（B） CDK7在整个细胞周期中在T170和S164上都被磷酸化。从异步（A）HeLa细胞（3号通道）和G同步细胞制备的提取物1、S、G2在含有PDA的凝胶中进行SDS-PAGE，并用抗CDK7抗体进行免疫印迹分析。左侧显示了未磷酸化（CDK7）和单磷酸化和双磷酸化（CDM7-P）CDK7亚型的活性；昆虫Sf9细胞双重感染后纯化的CDK7细胞周期蛋白H二聚体复合物（D）主要含有双重磷酸化形式，而三次感染产生的CDK7细胞周期蛋白H-MAT1三聚体复合物（T）仅含有非磷酸化形式。（C）在HeLa细胞有丝分裂时CAKAK达到峰值。将含有～1μg CDK7-HA（S164A）（1至6道）或CDK7-HA（S164A/T170A）（7至12道）的裂解液与1μg纯细胞周期蛋白H混合，并在不进一步添加蛋白质（1道）的情况下培养，或与200 ng活化的CDK2-细胞周期蛋白A（2道和8道）、1μg纯种MAT1-His（7道）或50μg来自g中HeLa细胞的裂解液培养1（车道3和9）、S（车道4和10）、G2（车道5和11），或M相（车道6和12）。然后对CDK7-cyclin H复合物进行免疫沉淀，并测试其磷酸化CDK2的能力（左下箭头所示）。CDK7（高箭头）也在反应中磷酸化。（D） 有丝分裂提取物中CDK2的免疫缺失会略微降低CDK7-活化激酶，而CDC2的免疫缺失则会将CDK7活化降低到没有提取物时观察到的背景水平。用CDK2（αCDK2）、CDC2（αCDC2）或GST（模拟）抗体对有丝分裂提取物进行两轮免疫耗竭。将耗尽的提取物与从Sf9裂解物中免疫沉淀的CDK7-HA（S164A）和1μg纯cyclin H在MgCl存在下孵育2和ATP。然后检测CDK7-cyclin H复合物对RNA聚合酶II CTD的活性。通过液体闪烁计数对活性进行量化，并将残余活性表示为模拟贫化提取物（mock）（定义为100%）中活性的百分比，如每个泳道下方所示。（E） CDC2激活CDK7的效率高于CDK2。如面板D所述，有丝分裂提取物的CDC2或CDK2免疫缺失。免疫沉淀激酶与含有CDK7-HA（S164A）和纯细胞周期蛋白H的裂解物在MgCl存在下孵育2和ATP。然后对CDK7复合物进行免疫沉淀并分析其对CTD的活性。然后清洗含有免疫沉淀CDC2或CDK2的珠子，并检测其对组蛋白H1的活性。通过PhosphorImager扫描对活性进行定量。
图4
图4
CDC2和CDK2磷酸化S164和T170上的CDK7。按照材料和方法中的描述进行了色氨酸磷酸肽定位。（A） 通过活化的CDK2-cyclin A复合物对CDK7进行磷酸化（如图2A第2栏所述）导致两种胰蛋白酶肽（1和2）的强磷酸化。这些斑点与体内CDK7磷酸化产生的两种主要磷酸肽相结合（数据未显示）。（B） CDK7（T170A）在体外磷酸化生成的图谱缺少斑点2。（C） 体外CDK7（S164A）磷酸化生成的图谱缺少斑点1。（D） 体外CDK7激酶缺失突变体K41A的磷酸化。分别对应于S164和T170磷酸化的点1和点2是用纯CDC2-cyclin B在体外生成的。（E） 通过野生型CDK7的自身磷酸化产生的磷酸肽图（在化学计量量的细胞周期蛋白H存在的情况下）。与CDC2和CDK2反应相比，用四倍多的放射性标记的ATP进行自磷酸化反应，需要两到四倍的自射线照射时间。对于所有图谱，第一维的薄层电泳（TLE）是从左（+电极）到右（-电极），第二维是升序薄层色谱（TLC）。样品在原点（+）处发现。
图5
图5
CDK2-7的构建和体外磷酸化。（A） CDK2-7混合T回路示意图。CDK2-7是通过将CDK2的T环替换为CDK7的类似序列而构建的，共有六个氨基酸发生了变化。转换为CDK7序列的区域由装箱残基表示，而星号表示CDK2和CDK7之间实际不同的位置。（B） 与细胞周期蛋白a复合物中的纯CDK2-7在体外（通道1）被CDK7-cyclin H有效磷酸化，磷酸化水平显著高于背景自磷酸化水平（通道2），与CAK介导的野生型CDK2-cyclin a磷酸化水平相当（通道3）。CDK2/2-7、CDK2（车道3和4）和CDK2-7（车道1和2）。（C） CDK7-cyclin H磷酸化激活CDK2-7。CDK2-7的CTD激酶活性取决于与细胞周期蛋白A的结合以及CDK7-细胞周期蛋白H的激活（将车道5与车道4和6进行比较），野生型CDK2的CTD酶活性也一样（将车道2与车道1和3进行比较）。（D） CDK2不能磷酸化CDK2-7。通过与CDK7-cyclin H预孵育激活的CDK2-cyclin A无法在背景水平以上磷酸化CDK2-7-cycliin A（通道1），可能是由于自磷酸化（通道2），尽管它对组蛋白H1（通道4）具有活性。作为对照，与细胞周期蛋白a复合的CDK2-7被CDK7细胞周期蛋白H磷酸化（泳道3）。
图6
图6
CDK2-7在S154和T160上被CDK7-cyclin H磷酸化。薄层色谱法。TLE，薄层电泳。（A） CDK2、-7和-2-7的标记和胰蛋白酶消化产生的预期T环磷酸肽图。预期作为磷酸化目标的残基用星号表示，肽根据该残基的身份和数量命名（在右括号中）。CDK2-7的S154肽和CDK7的S164肽是相同的，因此是复合的。虽然它们不完全相同，但CDK2-7和CDK2的T160肽也应该合并；肽中的两个氨基酸差异预计不会对其在任何维度上的流动性产生任何影响（3）。（B） CDK7-cyclin H标记的CDK2-7的胰蛋白酶磷酸肽图谱有两个斑点，对应于T环中S154和T160上的标记（由标签指示）。另外出现了三个斑点，可能代表非T环残基的磷酸化（见正文）。（C） CDK7-cyclin H对CDK2的磷酸化产生一个与T160上磷酸化相对应的主要斑点。（D） 活化的CDK2-cyclin A使CDK7磷酸化产生两个主要斑点，对应于S164和T170处的磷酸化（图3）。（E） 标记的CDK2-7和CDK2的混合显示了这些CDK中每一个的T160肽的结合，这表明CDK2-7.实际上是在T160上磷酸化的。与S154肽上的磷酸化相对应的斑点是可见的，其在源自野生型CDK2的图谱中没有对应物，三个斑点被认为是由于T环外的磷酸化。（F） CDK7和CDK2-7样品的混合产生一个强度增加的主要斑点，对应于S154和S164磷酸肽的结合。与T160和T170磷酸肽相对应的两个斑点是可见的，这两个斑点预计不会合并，正如之前归因于非T环磷酸化的斑点一样。
图7
图7
CDK2-7保留了野生型CDK2的底物特异性。（A） CDK2（车道1至3）或CDK2-7（车道4至6）预先孵育，在每条车道上方显示细胞周期蛋白A和CDK7-细胞周期蛋白H的组合。通道7，控制缺乏任何CDK-7激活激酶。当被细胞周期蛋白A和CAK激活时，CDK2（第2通道）和CDK2-7（第5通道）都能够磷酸化固定在蛋白A-Sepharose珠上的HA标记的CDK7。CDK2仅通过细胞周期蛋白A（通道1）轻微刺激其对CDK7的活性，而当单独与CDK7-细胞周期蛋白H预孵育时，CDK2和CDK2-7均未对CDK6产生任何活性（通道3和6）。CDK7-HA未表现出明显的自磷酸化（通道7），表明任何信号都是由CDK2或CDK2-7的磷酸化引起的。（B） 通过与纯CDK7-cyclin H孵育激活的CDK2-7–cyclin A无法磷酸化纯CDK2-cyclin B（通道2），尽管它对组蛋白H1（通道3）具有活性。CDK2-cyclin A被CDK7-cyclin H直接磷酸化（通道1）。
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