多囊藻毒素-1是BIN1表达和T小管重塑的关键调节因子，与扩张型心肌病的发生相关

摘要

心肌病常见于常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者，即使他们的肾功能和动脉压正常。心肌细胞多囊蛋白-1（PC1）在心血管病理生理学中的作用尚不清楚。PC1是维持T小管结构的BIN1的潜在调节器，BIN1表达的改变会导致心脏疾病。我们使用心肌细胞特异性PC1-沉默（PC1-KO）小鼠模型，探讨心肌细胞PC1在心力衰竭（HF）发展中的相关性，将BIN1表达减少诱导T小管重塑视为一种潜在机制。通过超声心动图检测，PC1-KO小鼠表现出心脏功能受损，但在7-9个月大之前没有心衰迹象。在PC1-KO小鼠中，43%在7个月大时突然死亡，100%在9个月后死于扩张型心肌病。PC1-KO小鼠的总BIN1 mRNA、蛋白质水平及其在血浆膜富集组分中的定位降低。此外，在没有HF症状的小鼠中，BIN1+13亚型减少，而BIN1+1 3+17亚型过度表达。然而，在HF小鼠中未观察到BIN1+13+17过度表达。血浆样本中测得的T小管重塑和BIN1评分与PC1-BIN1表达减少和HF发展相关。我们的结果表明，心肌病细胞中PC1表达降低导致扩张型心肌病，与BIN1表达降低和T小管重塑相关。总之，PC1对BIN1表达的正向调节提示了一种新的途径，可能与理解ADPKD患者心肌病的病理生理机制有关。

1.简介

常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是一种由多囊肾病1基因突变引起的遗传性肾病(PKD1系列)和/或PKD2系列[1，2]，其中PKD1系列突变导致ADPKD最严重的表现[三，4]。心血管疾病是ADPKD患者最常见的死亡原因，最近提出了多囊肾病心肌病的概念[1，5，6，7]。事实上，ADPKD与特发性扩张型心肌病（DCM）的发展有关[6，7，8]。然而，尽管有这样的见解，关于心脏病理学的分子和细胞机制的知识包括PKD1系列/PKD2系列是稀缺的。

心血管细胞中的多囊藻毒素功能障碍可能导致ADPKD的心脏后果。这个PKD1系列和PKD2系列基因分别编码多囊蛋白-1（PC1）和多囊蛋白-2，它们是在包括肾上皮细胞和心肌细胞在内的多个细胞中表达的跨膜蛋白家族的成员[9].

先前关于心肌细胞（PC1-KO）中PC1选择性沉默的年轻小鼠（9-11周龄）的报告显示收缩和舒张功能障碍，L型钙通道（Cav1.2）蛋白水平降低，钙瞬变减少[10]心肌细胞动作电位持续时间缩短[11]没有任何痛苦、肥大或心力衰竭（HF）的迹象。这些结果表明，心肌细胞中表达的PC1对维持正常的心脏功能和钙稳态是必要的[10，11]; 然而，PC1调节心脏功能的机制尚不清楚。

膜支架蛋白桥联整合子-1或两性激素-2（BIN1）是一种心脏横小管蛋白，负责T小管膜微结构域的形成和钙的处理，对正常的搏动收缩性至关重要[12]。BIN1，BIN-amphiphysin/Rvs（BAR）域蛋白超家族成员[13]，由一个具有20个外显子的基因编码，这些外显子被选择性剪接以产生在不同组织中表达的几种异构体[12，14]。心脏组织中表达四种不同的亚型：一种小的组成性BIN1（BIN1+12），一种组成性选择性剪接的BIN1+1 7，以及两种心脏选择性剪接变体：BIN1+13和BIN1+3+17[12，15].

BIN1的二聚体通过其N末端结构域插入膜，引起内陷，从而开始形成小管[14，16]。此外，BIN1+13和BIN1+13+17在T小管的形成、丰度和功能中起着关键作用[12，14]以及支持心脏二联体形成的微区[13，14，15]。心脏条件下BIN1缺失的成年小鼠表现出T小管微折叠缺失、T小管管腔直径增加、心脏兴奋-收缩耦合受损[12]和心脏收缩力，Cav1.2蛋白水平降低[17]随着时间的推移，发展为扩张型心肌病[18]。事实上，BIN1被下调，心肌细胞T小管超微结构的改变早于心衰[17，19，20]。此外，血浆中BIN1水平的降低与人类HF的发生有关[21，22，23]这表明它可能有潜力成为一种新的生物标志物；然而，调节BIN1表达的途径仍不明确。

由于T小管对维持心脏收缩力至关重要，而BIN1是小管生成的关键蛋白，我们假设PC1调节心脏组织中BIN1的含量，从而保持T小管结构和心脏功能。在本研究中，我们使用心肌细胞特异性PC1-KO小鼠模型评估了PC1在调节BIN1亚型表达中的相关性及其在心力衰竭发展中的相关性。

考虑到ADPKD患者会发展为心肌病，并且在小鼠模型中心脏特异性PC1-KO会导致心脏功能障碍[10]，我们重点确定BIN1的表达和T小管的形成是否依赖于PC1。这些知识可能有助于理解PC1调节心脏功能的机制，并导致ADPK患者心肌病的发展。

2.结果

2.1. 扩张型心肌病猝死与多囊藻毒素-1表达缺失相关

年轻小鼠（9-11周龄）的心肌细胞特异性PC1-敲除（PC1-KO）降低了心脏功能，但未导致心率变化、心肌肥厚或HF或心衰症状[10，11]。因此，我们研究了心肌细胞PC1表达缺失对成年小鼠心衰进展和寿命的影响。

PC1-KO小鼠在7个月内发育正常。在接下来的2个月里，他们表现出突然发作的呼吸困难、浅呼吸、活动受限和疲劳。这些迹象出现后一到两天，这些动物就死了。大约43%的PC1-KO小鼠在7个月大时突然死亡，其余的在接下来的两个月内死亡。存活曲线如所示图1答：。

我们通过超声心动图评估了无HF症状（<7月龄小鼠）和有HF症状的小鼠（7-9月龄鼠）的心脏功能。我们的数据(图1B） 发现<7月龄小鼠的射血分数降低（对照组EF:72.4±4.3%，PC1-KO:56.7±3.9%），7-9月龄小鼠EF:69±3.7%，PC1-KO:42±4.0%）。此外，<7月龄小鼠（对照组FS:38.6±2.5%，PC1-KO组为25.3±2.3）和7-9月龄小鼠中检测到缩短分数（对照组为33.3±2.5%、PC1-KO组为18±1.6%）(图1C） 。我们还评估了PC1-KO小鼠第一次出现痛苦迹象时的心脏形态学、形态计量学和分子参数。苏木精/伊红染色的代表性心脏如图所示(图1D） ●●●●。如图所示，来自PC1的小于7个月大的心脏^前/后和PC1-KO似乎相似，但7-9个月大的PC1-KO小鼠的心腔明显扩张。超声心动图证实腔室扩张(补充图S1A-D). 我们观察到7-9个月大的PC1-KO小鼠的左心室收缩末期（LVEsD）和舒张末期（LVEdD）尺寸增加（对照组LVEsD:1.78±0.18 mm，PC1-KO:3.15±0.4 mm，对照组LVEdD:2.67±0.16 mm，PC1-KO:3.75±0.39 mm），而小于7个月龄的PC1-KO小鼠与对照组相比没有显著差异。7-9月龄小鼠的心脏重量/胫骨长度（HW/TL）从10.7±0.6增加到17.2±1.1 mg/mm（60%），<7月龄小鼠无明显变化(图1E） ●●●●。心脏重量的增加与肺湿重/胫骨长度（LWW/TL）有关，在7-9个月大的小鼠中，其变化范围为11.3±0.5至15.2±0.7 mg/mm（35%）(图1F） ●●●●。7-9个月龄PC1-KO小鼠心脏中β-MHC、BNP、TGF-β、CTGF和胶原蛋白1（Col1）mRNA表达水平增加，用作心脏应激和纤维化的标记物(补充图S1E-I). 此外，PC1的Masson三色染色^前/后PC1-KO心脏胶原沉积没有任何差异(补充图S1J). 总之，这些数据表明，心肌病细胞特异性PC1缺陷会导致心脏功能障碍，随着时间的推移会发展为心肌病和猝死。此外，我们在HF症状出现之前没有检测到肥大标记物的变化，这与之前报告中描述的观察结果一致[10].

2.2. 多囊藻毒素-1调节心脏BIN1的表达

由于BIN1表达减少与心力衰竭的发生有关[22]，我们评估了PC1是否调节心室心肌组织中的心脏BIN1蛋白含量。我们的结果没有显示7日龄PC1之间BIN1蛋白含量的差异^前/后和PC1-KO小鼠(补充图S2A); 然而，与PC1相比，<7月龄和7-9月龄PC1-KO小鼠的总BIN1蛋白水平下降至对照水平的50%左右^前/后老鼠(图2A、 B）。使用识别不同BIN1氨基酸序列的第二种BIN1抗体（ab95022）获得了类似的免疫印迹结果(补充图S2B-D). 此外，心脏组织中BIN1蛋白水平的降低与PC1-KO小鼠中BIN1总mRNA含量的降低有关，甚至在任何HF症状出现之前就已检测到(图2C、 D）。综上所述，这些结果表明PC1对维持心肌细胞中BIN1蛋白的表达至关重要。

有趣的是，对心脏组织中BIN1蛋白水平随时间变化的评估显示，PC1中与年龄相关的该蛋白水平增加^前/后老鼠。相反，在PC1-KO小鼠中未观察到BIN1蛋白随年龄增加(补充图S2E，F).

富含PC1-KO和PC1质膜组分（MS）的微粒体组分^前/后用小鼠研究BIN1膜的定位。除了PC-1-KO心脏组织总蛋白水平下降外，<7月龄PC1-KO小鼠的细胞膜组分中还存在BIN1(图2E） 和7-9个月大的PC1-KO小鼠(图2F） 与PC1相比^前/后老鼠。

总之，这些数据表明，心肌细胞中PC1表达的缺失导致BIN1表达和膜定位的降低，即使在观察到HF典型的痛苦迹象之前，也可以检测到这些变化。这些结果表明PC1是以前未被识别的心脏组织中BIN1表达的调节器。

2.3. 多囊藻毒素-1对心脏BIN1同工酶表达的调节

由于PC1-KO小鼠的总BIN1 mRNA减少，我们通过测量出现痛苦迹象之前（<7个月）和之后（7-9个月）PC1-KO-小鼠心脏组织中BIN1剪接变异体mRNA的水平，评估PC1是否导致BIN1表达的异型特异性变化。如图所示(图3A、 B），即使在检测到任何应激迹象之前，PC1-KO小鼠心脏组织中心脏特异性BIN1+13亚型的表达都会降低，而令人惊讶的是，PC1-KO小鼠心肌组织中心脏特异性BIN1+1 3+17亚型的相对丰度增加(图3C） 与对照组小鼠相比。PC1-KO小鼠心脏组织中观察到的BIN1+13+17亚型的增加是暂时的，因为与对照小鼠相比，有明显HF症状的PC1-KO小鼠的BIN1+13+17亚型水平降低(图3D） ●●●●。对于普遍存在的BIN1亚型、BIN1+17和小BIN1，蛋白质水平在小鼠出现痛苦症状之前没有变化；然而，在有HF症状的PC1-KO小鼠的心脏组织中，它们的水平显著下降(补充图S3A–D).

总之，这些数据表明，BIN1总mRNA的减少主要是由于BIN1+13亚型转录物的丢失。另外，在PC1-KO小鼠中，BIN1+13+17亚型的暂时优势可能反映了一种机制对抗HF发病的结果。为了评估BIN1亚型的变化是否是PC1表达减少的直接结果，我们使用了PC1被敲除的NRVM(补充图S3E). 我们的结果表明，当BIN1+13 mRNA减少时，BIN1+1 3+17 mRNA增加(补充图S3F，G). 此外，与对照组相比，siPC1 NRVM中普遍存在的BIN1（BIN1+17和小BIN1）亚型的mRNA水平没有改变(补充图S3H，I)，支持我们之前在<7个月大的PC1-KO小鼠中的发现，并表明BIN1的表达直接依赖于心肌细胞中PC1的表达。此外，NRVM中PC1的过度表达增加了除BIN1+13+17 mRNA外的所有BIN1 mRNA亚型，后者减少(补充图S3J–M)

2.4. T小管超微结构与心肌细胞多囊藻毒素-1表达的变化

超微结构和T小管的形成取决于心脏BIN1亚型的表达，两者的变化与HF发病有关[15]。因此，我们利用透射电子显微镜（TEM）研究了PC1-KO小鼠心脏T小管的超微结构，并显示了典型的TEM图像(图4A） ●●●●。我们的观察表明管腔面积增加(图4B） 而PC1-KO心肌组织中心肌细胞T小管的腔内电子密度（作为微折叠的测量）下降(图4C） 甚至在出现窘迫症状之前（<7个月大的小鼠）也是如此。与PC1相比，这些变化在7–9个月大的PC1-KO小鼠心肌细胞中保持不变^前/后老鼠(图4D、 E）。有趣的是，比较<7月龄和7-9月龄PC1-KO小鼠的心肌细胞T小管后，管腔面积和管腔内电子密度分别增加和减少(图4F、 G），这些变化与HF进展相关。此外，虽然<7个月大的PC1-KO小鼠的心脏每个区域的T小管数量没有变化，但与PC1小鼠相比，7-9个月大PC1-KO小鼠的每个区域的T-小管数量有所减少^前/后老鼠(图4H、 I）。

总的来说，这些数据表明心肌细胞T小管超微结构的维持至少部分依赖于PC1的表达。此外，根据PC1-KO小鼠的超声心动图测量，T小管超微结构的改变与心脏收缩功能障碍有关，即使在观察到任何心衰迹象之前，这些变化都是可以检测到的（比较图4B、 C带图1B、 C）。

2.5. 心肌细胞多囊藻毒素-1基因敲除小鼠血浆BIN1+13+17水平与心脏表达的相关性

血浆中心脏BIN1+13+17（cBIN1）亚型水平与心肌细胞的表达水平成正比[14]cBIN1评分（CS）与血浆BIN1+13+17含量成反比，提示它可能是早期检测HF的新生物标志物[21，22]。然而，缺乏心力衰竭迹象前cBIN1评分的相关信息。由于我们发现PC1-KO小鼠心脏组织中的BIN1+13+17 mRNA增加，在发现任何HF迹象之前，我们决定在疾病发展的这个阶段（<7个月大的小鼠）测定PC1-KO小鼠血浆中的CS。有趣的是，CS降低(图5A） 在KO血浆中观察到，与PC1的观察值相比^前/后老鼠。这些观察结果支持这样的观点，即尽管PC1的缺失与总BIN1的表达减少有关，但BIN1+13+17亚型水平增加。相反，与亚型mRNA水平一致，患有HF症状的PC1-KO小鼠的BIN1评分增加(图5B） ●●●●。

根据这些结果，与对照组相比，BIN1+13+17血浆水平和CS的任何变化都可能与心功能不全有关，并可能作为明显心衰之前心脏功能不全的生物标志物。

综上所述，这些数据表明，PC1是一个关键的机械传感器，维持心肌细胞中基本cBIN1的表达，对T小管的形成、组织超微结构的保存和心脏功能至关重要。此外，PC1表达的放松调节通过降低某些cBIN1亚型的表达而导致心脏功能障碍，从而导致T小管改变，随着时间的推移演变为扩张型心肌病、心力衰竭和猝死。在图6，本研究最重要的发现总结在一个图形模型中。

3.讨论

尽管肾功能和动脉压正常，但许多ADPKD患者仍发展为心肌病，这表明心血管疾病可能是心脏和血管组织中多囊蛋白突变和功能障碍的结果，而不是肾功能障碍的结果。然而，这个问题仍然不清楚，而且相互矛盾[5，6，24，25，26].

有趣的是，在一组ADPKD患者中，6%的患者发展为特发性扩张型心肌病，而只有2.5%的患者发展为肥厚性阻塞性心肌病[6，26]。我们的结果首次在临床前小鼠模型中显示，多囊蛋白-1（PC1）的表达改变，特别是在心肌细胞中，与扩张型心肌病、心力衰竭的发展和与年龄相关的猝死直接相关。此外，尽管PC1-KO小鼠从9周龄起表现出射血分数下降（通过超声心动图测量）[10]，直到7个月大左右，它们才会表现出任何压力的迹象。此时，43%的PC1-KO小鼠突然死亡，到9个月时，所有小鼠都死于明显的心力衰竭症状。考虑到老鼠和人类寿命的差异[27]，将心力衰竭的最初症状推断到人类年龄大约相当于23-30岁。事实上，27岁的ADPKD患者的心血管并发症（如高血压）的临床症状和体征已有描述[26]32至34岁[28]。与我们的小鼠模型相比，患者在临床症状、短暂发作和严重程度上的差异可能至少部分归因于心肌细胞特异性敲除对这两种细胞都有影响第1页等位基因，而ADPKD患者有杂合突变。另一方面，一名8个月大的女孩患有多囊肾病，她突然发展为扩张型心肌病，在症状出现3小时后死亡[7]。一致的是，我们在小鼠敲除中的观察结果表明，心肌细胞中PC1表达或功能的降低是非常有害的，并会促进HF的发展。

据报道，T小管断裂、丢失和重塑是导致心力衰竭发展的关键事件[20，29，30，31，32]; 然而，调控肾小管生成的途径尚不完全清楚。Amphyphyn-2或桥联整合子-1（BIN1）参与小管生成和T小管超微结构的形成，两者对维持心脏功能至关重要[33，34]。事实上，BIN1的心肌特异性缺失可诱导年龄相关的扩张型心肌病，从8-10个月大开始[18]在异丙肾上腺素诱导的病理性肥大模型中，外源性cBIN1的体内过度表达降低了心肌重塑和功能障碍[35]。其他研究表明，BIN1保留了T小管，尤其是微血管结构，从而避免了HF的发生[12，14，36]。我们的结果表明，PC1是心脏组织中BIN1表达所必需的，PC1表达的降低降低了BIN1的表达并改变了其在质膜上的定位。有趣的是，我们的结果表明，BIN1的表达在小鼠的整个生命周期中都会增加，这种增加可能与延长动物的健康状况有关。这可能解释了为什么随着动物年龄的增长，PC1的表达或功能降低会使其更容易患心肌病。

另一方面，两种不同的心脏BIN1亚型被描述为与T小管的形成和超微结构有关[12，15]。虽然BIN1+13被认为是心脏组织中对T小管形成非常重要的主要亚型，但BIN1+1 3+17与微血管维持的关系更大[12，13]。尽管心脏组织特异性PC1-KO小鼠射血分数降低，但没有任何心衰迹象，总BIN1和BIN1+13 mRNA水平较低，但发现BIN1+1 3+17 mRNA水平升高。有趣的是，这种亚型水平的增加在以后不再被观察到。相反，它与扩张型心肌病症状的出现有关，这表明BIN1+13+17水平的增加最初可能会阻止有害的T小管重塑和心力衰竭的发生。此外，有HF症状的小鼠心脏组织中BIN1+13+17过度表达的缺失与单位面积微血管和T小管数量的大幅减少相关。这些数据与以前的报告一致，表明该BIN1亚型的过度表达足以避免T小管重塑和心脏功能障碍[37]。此外，发现T小管管腔面积的增加和微血管数量的减少与维持基础离子流所需的T小管模糊空间的丧失导致的心脏功能障碍有关[12]。这一观察结果至少可以部分解释PC1-KO小鼠在没有HF症状的情况下观察到的心脏收缩功能异常。

BIN1+13+17被认为是一种新的心力衰竭生物标志物。事实上，已有报道称，这种BIN1亚型的水平降低，表现为射血分数保持或降低的心力衰竭患者血浆样本中BIN1评分增加，并与这些病理相关[21，22，23]。相反，我们的数据显示，KO小鼠血浆中BIN1评分下降，没有任何HF迹象，但心功能下降。这种明显的矛盾至少可以部分解释，因为小于7个月大的PC1-KO小鼠尚未出现任何心力衰竭迹象。此外，我们的数据支持我们之前在这些小鼠中的发现，表明与对照组相比，心脏组织中BIN1+13+17的表达水平增加。有趣的是，这些结果表明，即使在典型症状尚不明显的情况下，BIN1血浆水平的任何变化都可以用来预测未来的心脏功能障碍。

此前，我们和其他人已经证明PC1在维持幼鼠正常心脏功能方面发挥着重要作用[10，11]。因此，BIN1表达的调节可能代表PC1维持正常心脏功能的部分途径。需要进一步研究以确定PC1调节心脏组织中BIN1表达的具体机制。

如前所述，PC1调节心肌细胞BIN1表达的途径尚不清楚；然而，转录因子，如c-Myc，被认为是BIN1表达的抑制剂[38]。此外，在肾细胞中描述了PC1和c-Myc途径之间的有趣联系[39]。需要进一步的研究来确定c-Myc是否参与心肌细胞中连接PC1和BIN1的途径。

从翻译的角度来看，我们发现PC1是BIN1表达的阳性调节剂，揭示了ADPKD患者心肌病的新机制。在PC1-KO小鼠中观察到的BIN1+13+17表达的特异性增加可能代表了一种早期代偿机制，这种机制随后会丢失，从而导致HF。由于BIN1组织了正常肌肉收缩所需的T小管膜钙处理微区，并且T小管重塑在不同病因HF的早期发生，包括扩张型心肌病在内，BIN1基因治疗可以挽救衰竭心脏的心脏功能。这些结果确定了维持钙稳态和预防/改善心肌病发展的潜在治疗靶点。

4.材料和方法

4.1. 动物

所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（2011年第8版），并获得智利大学机构伦理审查委员会（CBA#0997）的批准。我们使用男性C57BL/6对照（PC1^前/后)和心肌细胞特异性PC1-敲除（PC1-KO）小鼠，如前所述获得[10]。在使用之前，动物一直被保存在标准条件下。我们使用Sprague–Dawley幼鼠（1-3天）分离新生大鼠心室肌细胞（NRVM）。

4.2. 超声心动图和形态参数

对麻醉小鼠（异氟醚，0.5-1%）进行超声心动图检查，并如前所述分析缩短分数、射血分数、左心室舒张末期和收缩末期尺寸[10]。从颈部脱位麻醉和安乐死的小鼠获得心脏，并记录形态计量学参数（心脏重量/胫骨长度和肺湿重/胫骨长）。在7天后、9周后、任何可检测到的应激迹象（<7月龄小鼠）之前和应激迹象（7-9月龄鼠）明显之后，从小鼠获取心室心脏组织样本。呼吸困难、呼吸浅、活动受限和疲劳被视为压力信号。所有组织在液氮中冷冻，并保持在−80°C，直到蛋白质或mRNA收集或组织学固定。

4.3. NRVM培养和转染

如前所述，进行NRVM培养并转染PC1特异性siRNA（siPC1）[40]。简言之，NRVM用胰酶（1μg/mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）消化，并在预载明胶（2%，Sigma Aldrich）的平板中培养。在转染siPC1（120 nM，Sigma-Aldrich）之前，NRVM培养24小时。转染48小时后，用NRVMs获得mRNA。

如前所述，在NRVM中转导了人全长、膜锚定PC1 C末端（FLM-PC1，Thomas Weimbs馈赠，对应于Addgene质粒#41567）[40]。空白载体（巨细胞病毒（CMV））作为对照。转导48小时后，测定BIN1亚型mRNA。

4.4. 蛋白质提取和Western Blot分析

使用低温T-PER缓冲液（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）和蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Roche，Basel，Switzerland）从小鼠心脏中提取蛋白质。蛋白质浓度通过Bradford方法测定，蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜（Millipore Corp，Burlington，MA，USA），并进行免疫印迹。使用了两种不同的抗BIN1一级抗体：Abcam ab185950，可识别400个氨基酸直至C末端，以及ab95022，可识别189–398个氨基酸。Anti-GAPDH（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）被用作内务管理控制。与适当的二级抗体孵育后，通过ECL（英国阿默沙姆生物科学公司）检测抗原抗体反应，并使用Image Lab软件量化条带。

4.5. 膜组分的富集

如上所述收集心脏。在置于冰上的盘中用陶瓷刀将组织切碎，然后在玻璃/玻璃匀浆器中以1:5的比例匀浆(w个/v（v）)添加蛋白酶抑制剂（罗氏）的蔗糖缓冲液（0.3 M蔗糖和10 mM HEPES，pH 7.4）。匀浆在5000×克和4°C离心15分钟以去除碎屑。将上清液保存在冰上，将沉淀重悬并以相同的速度再次离心15分钟，将两种上清液合并并以15000×克收集产生的上清液，并将KCl添加到0.6 M的最终浓度。此悬浮液在120000×克在4°C下保持80分钟。将富含表面膜成分的微粒体颗粒重悬于蔗糖缓冲液中，并保持在−80°C。在随后的实验中，上清液部分被称为细胞溶质部分。蛋白质浓度用Bradford法测定。

4.6. RNA分离和qRT-PCR

如前所述[40]使用TRIzol试剂（Invitrogen，Waltham，MA，USA）和氯仿从组织和NRVMs样品中分离出mRNA。获得水相，并在异丙醇存在下沉淀RNA。RNA在无DNase/RNase的ddH中重组₂O.使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从每个样品中收集总共150 ng RNA。cDNA用ddH稀释10倍₂O并用于定量PCR分析（Step One Plus，Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）。使用ΔΔCt方法计算特定引物的相对转录丰度[10，12].

4.7. 组织学

对用多聚甲醛（4%）固定并保存在PBS（1×）中的组织样品进行苏木精/伊红或Masson三色染色，然后进行石蜡包埋。图像是在20倍放大率下获得的。

4.8. 透射电子显微镜（TEM）

如前所述固定心脏组织样本[12]。使用配有iTEM Olympus Soft Imaging Solutions（Windows NT 6.1）捕获软件的透射电子显微镜Philips Tecnai 12（加拿大魁北克省魁北克市BioTwin）在26500倍放大率下获得图像。从<7月龄和7-9月龄小鼠的每个组织样本中分别测量了113和223个T小管。使用ImageJ软件2.0.0-rc-43/1-50e版计算T小管管腔面积和密度[12]。计算每个区域的T小管数量（μm²).

4.9. 血浆心脏BIN含量

最终通过腔静脉抽血获得全血。简单地说，用吸入性异氟醚（0.5–1%）麻醉小鼠。然后，将血液抽取到含有EDTA的试管中，在2250×克血浆样品在使用前在−20°C下冷冻20分钟。心脏BIN1，特别是BIN1+13+17亚型（cBIN1），是使用由Sarcotein Diagnostics提供的cBIN1特异性ELISA分析在血浆中测定的，结果显示为BIN1得分，这是血浆cBIN1的反向指数，由cBIN1血浆浓度的自然对数获得，根据制造商的协议。

4.10. 统计分析

生存曲线分析采用Kaplan–Meier方法。所有数据均表示为所示数字的平均值±SEM(n个)使用Shapiro–Wilk和Kolmogorov–Smirnov检验评估正态分布。使用学生的未配对数据比较两组的数据t吨检验或单因素方差分析，然后进行Tukey的多重比较后检验。差异被认为在第页< 0.05.

5.结论

我们的结果表明，在ADPKD患者中观察到的心脏病变可能是心肌细胞PC1功能障碍的直接结果。此外，我们确定机械传感器PC1是心脏组织中BIN1表达的一种新的调节因子，可能是维持小管形成、T小管超微结构和正常心脏功能所必需的。