肝脏在损伤后具有自我再生和恢复实质组织的卓越能力。肝脏生长/再生中最常见的细胞来源是原有肝细胞的复制，尽管肝祖细胞已被假定在大规模损伤的情况下参与肝再生。骨髓源性造血干细胞（BM-HSC）在特殊情况下具有作为肝再生来源的正式能力；然而，这一过程对肝组织维持和再生的影响仍存在争议。BM-HSC是否参与肝再生将引起特别关注，因为这些细胞被认为是治疗肝衰竭的替代供体来源。来自小鼠肝病模型的数据表明，BM-HSC可以重建肝组织并恢复肝功能；然而，从人类肝移植获得的数据显示，只有很少证据表明通过这种机制实现肝再生。肝再生的细胞来源似乎取决于再生过程的性质和损伤程度；然而，精确的机制仍然需要解决。目前的数据表明，在人类原位肝移植中，BM-HSC肝再生是一种相当罕见的事件，因此与临床无关。
1.简介
肝病是欧洲两个国家发病和死亡的重要原因[1]和美国[2]由于丙型肝炎感染、酗酒和肝硬化肝细胞癌，急性或慢性肝衰竭的发病率正在上升[三]. 重要的是，肝脏是唯一的重要器官（大脑除外），由于其功能的复杂性，无法被设备取代。原位肝移植（OLT）是急性或慢性肝衰竭的首选治疗方法，但由于全身器官短缺，导致等待治疗的患者死亡率增加。尽管由于手术技术、患者管理和免疫抑制策略的不断改进，原发性无功能、肝动脉血栓形成和急性排斥反应导致的早期移植物丢失可以忽略不计，细菌和真菌感染是OLT术后最初几个月大多数患者发病率和移植物丢失的主要原因。患者和移植物的一年生存率都在80%左右[4]大约50%的死亡发生在头6个月内。
通过肝细胞输注进行肝细胞移植的概念被认为是一种有希望的替代方案，与实体器官移植相比取得了重大进展[5]. 然而，由于功能益处的持久性有限，以及成熟肝细胞获取和储存的局限性，该方法主要用于婴儿先天性代谢错误，并作为OLT的桥接疗法[6]. 为了治疗遗传性或获得性肝病，替代细胞来源已成为基于细胞的肝再生医学研究的重点（图1). 因此，干细胞替代策略被认为是肝脏修复的一种有吸引力的替代方法。
2.骨髓源造血干细胞作为肝再生的来源
骨髓来源的造血干细胞（BM-HSC）具有产生多种细胞群的能力，包括造血细胞、成纤维细胞、内皮细胞和间充质基质细胞。然而，BM-HSC在肝细胞再生中的作用尚不清楚。
2.1. 来自小鼠模型的数据
肝再生过程主要依赖于已有肝细胞的复制；然而，据推测，肝细胞的来源取决于生长过程的性质和损伤程度，也可能涉及双功能前体细胞（卵圆细胞）和BM-HSC。能够参与肝细胞和胆管细胞生成的所谓椭圆形细胞被认为是BM-HSC的后代，因为它们共享一组造血标记物（c-kit、CD34、CD45等）[7]. 在一些动物模型中观察到BM-HSC转化为卵圆细胞；然而，由其衍生的肝细胞已被证明在其再生能力方面受损[8,9].
有趣的是，在I型致命遗传性酪氨酸血症小鼠模型中，BM-HSC已被证明能使肝脏重新繁殖并产生功能性肝细胞，从而导致进行性肝衰竭。为了纠正肝脏疾病，对富马酸乙酰乙酸水解酶（FAH）缺陷小鼠进行致命照射，并用野生型骨髓（BM）重建。FAH公司−/−与未经治疗的对照动物相比，骨髓移植（BMT）受体表现出显著的改善，组织学分析证实存在表达FAH酶的供体来源的肝细胞[10]. 然而，当塑性和体内在致死剂量照射的野生型BMT受体和副生物小鼠模型中检测BM-HSC的细胞命运特异性，嵌合仅限于造血系统。因此，非造血细胞类型的产生并不是正常BM-HSC的典型功能，转分化应被视为非常罕见的事件[11]. 最近的数据表明，供体源性肝细胞的发生不是由于转分化，而是由于宿主肝细胞与骨髓源性细胞的融合[12,13]. BM-HSC衍生的肝细胞可能是供体肝细胞和受体肝细胞的细胞融合产生的，随后是HSC供体基因组的重新编程，但确切的潜在机制和涉及的HSC类型尚待确定。尽管细胞融合被证明能够产生正常外观的肝细胞，并最终纠正FAH中潜在的代谢紊乱−/− 模型中，自发融合的频率很低，治疗人类肝脏疾病的疗效值得怀疑。
最近，研究表明，在大鼠OLT模型中，动员宿主干细胞和短期他克莫司可导致操作耐受和肝嵌合[26]. 这个实验模型 “逆嵌合体”不仅为临床OLT提供了一种潜在的耐受性方法，而且也为肝再生提供了一个潜在的治疗方法。然而，嵌合是否是BM-HSC转分化或融合的结果尚不明确，关于耐受诱导的机制问题仍悬而未决。
2.2. 性别不匹配的肝脏和骨髓移植的临床数据
移植后实体器官的微嵌合体状态已明确；然而，就肝脏而言，供体衍生肝细胞的存在似乎是一种罕见的事件。几个小组已经调查了OLT后受体衍生肝细胞群的发生和命运。在大多数研究中，OLT和BMT的性别不匹配病例被用来通过X和Y染色体的可视化来评估肝细胞的起源。免疫组织化学和荧光在里面-原地杂交（FISH）用于检测BM-HSC衍生肝细胞的存在。
然而，我们和其他人已经证明，BM-HSC在OLT后的肝再生中没有或很少参与[17,19,24]，其他研究报告了接受肝或骨髓移植的患者中供体肝细胞的发现[14–16,22,23]. BM-HSC衍生肝细胞的频率在百分比<1%和8%之间变化，一些作者使用了抽样误差修正。频率值与这些校正因子的乘积导致BM-HSC衍生肝细胞的报告频率高达43%[15]. 纵向进行的活检表明，肝细胞嵌合是一种早期事件（如果发生的话），与损伤的严重程度无关[22,23]. 几个小组检查了OLT后肝细胞嵌合体的状态，报告称在巨噬细胞、Kupffer细胞、肝内皮细胞和胆管中普遍存在大量嵌合体，而肝细胞嵌合只偶尔出现[18,20,21]. 有趣的是，最近的一项研究报告称，在儿童同种异体肝移植中，肝细胞嵌合体出现的频率很高[25]. 通过显微切割和微卫星分析，他们发现与FISH评估Y染色体相比，嵌合率更高；然而，肝细胞嵌合与损伤或结果无关，因此与临床无关（表1)。
迄今为止，从研究中获得的结果存在争议，这可能是由于几个原因。（1） 结果多见于小组患者（4～24例）。由于活检是出于临床原因（例如检测和评分排斥反应或丙型肝炎复发），与OLT和损伤程度相关的活检时间点在患者之间不具有可比性。需要对具有统计学相关性的患者队列和方案活检进行前瞻性（多中心）研究，以确认嵌合肝细胞的发现和生物学意义。（2） 不同的方法用于检测嵌合体。一些人可能会声称，由于切片和/或次优杂交效率，FISH方法导致对嵌合体的低估。另一方面，没有特定肝细胞标记物或没有使用共焦显微镜的组织学分析可能会导致模糊错误，因为在内皮细胞或Kupffer细胞中常见杂交信号。此外，校正因子可能会在假阳性数据中引入重大错误。通常，建议使用短串联重复序列（STR）/微卫星分析在DNA水平上检测微嵌合体更具特异性；然而，即使使用显微切割，也很难仅在不包括相邻的库普弗细胞或内皮细胞的情况下切割肝细胞。（3） 不同的免疫抑制方案或其他药物可能会影响BM-HSC的动员和转分化。临床研究和小鼠实验模型之间的差异也可能是由于选择压力。（4） 成人肝脏含有大量的肝干细胞和祖细胞，有助于其巨大的再生能力[27]. 因此，肝移植时未清除的循环干/祖细胞或肝细胞可能是肝嵌合体的原因。
还应注意的是，在长期同种异体肝移植中，没有证据表明供者衍生的实质细胞与肝组织有显著的重新聚集[28]. 考虑到现有的数据，BM-HSC转分化似乎不太可能显著促进OLT后的生理组织再生或同种异体移植接受。
3.间充质干细胞作为肝脏再生的来源
间充质干细胞（MSC）具有分化为功能性肝细胞样细胞和肝上皮细胞的潜能在体外[29,30]和BM-HSC一样，可以大量获得。此外，MSC已被证明有助于从头开始肝细胞生成[31–33]通过分泌营养分子促进组织再生[32,34,35]. 还证明MSC具有低免疫原性，并创造了免疫抑制的微环境[36]从而避免异基因排斥，这是HSC移植中的一个主要问题[37]. MSC和HSC的联合移植显示了这两个群体在骨血管形成中的协同作用[38]和心力衰竭[39]; 此外，建议MSC促进HSC扩张并促进植入[40,41]. 最近，MSC在四氯化碳诱导的肝损伤中显示出优于BM-HSC的归巢能力和对纤维化肝脏化学诱导炎症的调节。令人惊讶的是，该研究的作者报告MSC和HSC没有协同作用[42].
尽管MSC具有再生和免疫调节潜能，但由于安全性问题以及缺乏调节MSC肝细胞分化的分子数据，实验啮齿动物研究转化为临床研究受到阻碍。实验上的困难在于MSC可以从各种来源获得，包括骨髓、脐血和脂肪组织，到目前为止，对MSC进行分类的独特分子标记尚不明确。由于MSC的来源不同在体外分化方案，MCS培养物可能包含具有不同分化潜能的不同亚群[43].
这个在体外人MSC的分化潜能及其衍生肝细胞的功能能力已通过在体外功能分析显示肝细胞特征，包括白蛋白生成、糖原储存、尿素分泌、低密度脂蛋白摄取和苯巴比妥诱导的细胞色素P450活性。此外，功能已经过演示体内通过在肝脏中成功植入，然后表达HepPar1和白蛋白[44,45]. 重要的是，它们还被证明可以促进肝脏损伤后的肝脏修复体内[44,46,47].
MSC被认为在治疗肝脏疾病方面具有巨大潜力，由于其大量可用性，甚至可能优于原代肝细胞；然而，MSC向肝细胞分化的潜在机制以及肝移植的驱动机制仍有待解决。
4.骨髓源性干细胞与纤维化
肝纤维化是许多慢性肝病的主要原因，其主要特征是细胞外基质蛋白（主要是I型胶原）因肝损伤而大量沉积。胶原蛋白的积累会干扰肝脏的结构和功能，继而可能发展为肝硬化和肝衰竭[48]. BM衍生细胞被认为在不同的模型中有助于胶原蛋白的生成和纤维化[49–51]; 然而，它们对肝脏瘢痕组织形成的贡献仍存在争议[52–54].
在再生医学方面，BM-HSC和MSC被认为能够成功地提供实质细胞；然而，细胞外基质的命运在很大程度上仍然未知。骨髓细胞移植在实验性啮齿类动物模型中显示出抗纤维化作用，并通过减少四氯化碳诱导的肝纤维化来防止瘢痕组织的形成[55,56]. 骨髓源性细胞被证实能产生抗纤维化胶原酶，包括基质金属蛋白酶（MMP）2、MMP 9和MMP 13，并同时降低基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的表达[55,57].
早期临床研究（使用自体骨髓细胞）治疗晚期肝病纤维化表明BMC治疗的有效性和安全性[58,59]; 然而，需要进行更大规模的随机研究，以找到最佳细胞来源，并评估这种有前途的方法的疗效。阻碍这一有希望的方法临床应用的一个主要问题是缺乏非侵入性技术来量化肝纤维化，以评估疾病的进展或逆转。
5.结论
在过去十年中，对肝再生过程的研究得到了重视，尤其是因为干细胞疗法即将产生临床影响。从理论上看，肝细胞移植或干/祖细胞移植可以恢复肝功能，这可能是OLT的一个有吸引力的替代方案。重要的是，肝细胞的来源始终取决于生长过程的性质和损伤程度。虽然先前存在的肝细胞的复制是最常见和最有效的方式，但阻断此途径可以诱导卵圆细胞的复制和分化，在罕见的情况下，甚至可以诱导BM-HSC的募集。虽然肝脏具有超常的自我更新能力，但为了开发基于细胞治疗的治疗方法，肝脏修复的潜在机制仍有待阐明。
虽然成熟肝细胞移植未能达到临床效果（主要是由于可用性有限），但骨髓基质干细胞和骨髓间充质干细胞似乎是再生细胞治疗的理想候选对象。来自小鼠模型和临床试点试验的实验研究为单个细胞源移植的不同效果提供了新的见解。我们认为，对潜在机制的更详细了解是开发肝病细胞疗法的先决条件。
关于BM-HSC在肝移植中的参与，本文讨论的研究表明，尽管BM-HSC可能是上皮细胞和枯否细胞等的重要来源，但向肝细胞分化是一个相当罕见的事件。作为“转分化” 被提议通过细胞融合来代替[12]，人们预计这些细胞中会出现多倍体，这只在一项研究中有报道[14]. 此外，细胞融合后的基因重编程被认为与供体衍生肝细胞的生成有关，这对干细胞可塑性和转分化的范式提出了挑战。到目前为止，只有小鼠FAH才能实现肝细胞的功能恢复和潜在疾病的治疗−/− 该模型表明，基因改变导致的代谢紊乱和肝炎或酒精滥用导致的肝损伤在肝脏修复方面存在巨大差异。在这个特殊的模型中，强选择性压力模型似乎有利于细胞融合事件，导致表达完整FAH等位基因的肝细胞样细胞；然而，临床相关性仍需确认。细胞融合也被认为与其他著名的发育可塑性例子有关[9,14,30,60–63]; 然而，干细胞可塑性领域仍存在争议[12].
关于替代丢失或功能失调的肝细胞的治疗方法，我们认为，尽管肝外干细胞的使用具有令人兴奋的潜力，但仍有许多障碍需要克服，临床应用还有很长的路要走。人们讨论了干细胞对各种肝脏疾病的治疗潜力，目前有几个细胞群是研究的重点，所有这些细胞都显示了在肝脏中转化为肝细胞的能力在体外文化[64]; 然而，就治疗而言，最合适的细胞群体仍有待确定。一个令人兴奋的潜在应用是将干细胞用于组织工程，以种子培养人工器官的生物成分，尽管这种方法远没有临床应用价值。下一个十年更现实的方法是操纵参与肝组织修复的干细胞信号，以便通过治疗性干细胞群体的基因重编程实现受损肝脏的自我生成。
因此，尽管肝外干细胞可能为细胞治疗提供有希望的资源，但我们认为OLT后用BM-HSC衍生的肝细胞对肝脏进行生理性再生并不具有临床意义。尽管干细胞的使用可能是OLT的一个有吸引力的替代品，但还需要进一步研究来检验其作为肝脏再生细胞来源的潜力。
