孕酮受体激活通过转录抑制和蛋白质周转增加下调GATA3，促进乳腺肿瘤生长

摘要

介绍

转录因子GATA3参与乳腺发育，对维持管腔上皮细胞的分化状态至关重要。GATA3在乳腺癌中作为抑癌剂的作用已经确立，尽管仍需要深入了解GATA3表达缺失的机制。

方法

采用染色质免疫沉淀法研究孕激素对GATA3启动子转录因子募集的调节。我们通过western blot和反向RT-qPCR实验分别探讨孕激素对GATA3蛋白和mRNA表达的调节。共焦显微镜和在体外磷酸化研究旨在检测孕激素在其308残基中诱导GATA3丝氨酸磷酸化的能力。GATA3参与孕激素诱导的乳腺癌生长在体外扩散和体内肿瘤生长实验。

结果

在本研究中，我们证明孕激素激活的孕酮受体（PR）通过调节乳腺癌细胞中的转录和翻译后水平来降低GATA3的表达。在前一种机制中，zeste同源物2的组蛋白甲基转移酶增强子与激活的PR共同被招募到GATA3协议近端启动子，增加H3K27me3水平并诱导染色质致密化，导致GATA3 mRNA水平降低。这种转录调控与通过孕激素诱导的丝氨酸308处的GATA3磷酸化以及26S蛋白酶体介导的降解增加GATA3蛋白周转有关。PR激活后，这两种分子机制共同降低乳腺癌细胞中GATA3的表达水平。此外，我们证明，孕激素诱导细胞周期蛋白A2上调需要降低GATA3水平，而细胞周期蛋白A1介导细胞周期的G1至S期转变，据报道与乳腺癌预后不良有关。最后，我们表明，GATA3的下调是孕激素刺激两者所必需的在体外细胞增殖和体内肿瘤生长。

结论

在本研究中，我们揭示了孕激素诱导的PR激活通过转录和翻译后调节导致乳腺癌细胞中GATA3表达缺失。重要的是，我们证明了GATA3下调是孕激素诱导的细胞周期蛋白A2上调和孕激素诱导在体外和体内乳腺癌细胞生长。

介绍

孕酮是一种对乳房发育至关重要的卵巢类固醇激素，与乳腺癌的进展有关。孕酮受体（PR）主要以两种共表达的亚型PR-A和PR-B存在[1]编码在不同启动子的同一基因下游[2]. 配体结合触发一个以PR和染色质蛋白质组分为靶点的信号事件网络，导致染色质重塑，从而使转录因子进入DNA[三]. 核PR与共调节剂一起，直接通过DNA与孕酮反应元件（PRE）结合或间接通过与其他转录因子的系链相互作用，激活或抑制PR靶基因的转录[4]-[7]. 最近的全基因组研究表明，63%与转录基因调控相关的PR结合位点在PR结合位点内含有PRE[8]. 然而，其他PR结合位点缺乏强PRE突显了其他调控机制的相关性，如栓系、先驱转录因子结合和PR辅因子招募，这可能是细胞特异性PR池的原因[8].

另一方面，GATA转录因子家族参与细胞命运的决定[9]. 已经证明，GATA3在小鼠和人类发育中都是一个关键的调节因子，因为GATA3的结构性无效突变会导致胚胎死亡[10]. 最近的证据表明，GATA3是发育过程中乳腺末端芽中表达最高的转录因子[11]. 此外，GATA3的表达对于导管和肺泡腔细胞命运的规范和维持是必要的[11],[12]. GATA3对乳腺发育和管腔细胞命运的维持的需求表明，GATA3在乳腺癌场景中具有潜在的意义。利用小鼠乳腺肿瘤病毒LTR-driven polyoma middle T antigen（MMTV-PyMT）小鼠肿瘤进展模型，Kouros-Mehr等。证明与腺瘤相比，GATA3在癌中表达下调，并且GATA3是GATA家族转录因子中唯一在这两个亚群之间差异表达的成员[13]. 重要的是，GATA3表达的缺失标志着肿瘤分化的丧失和肿瘤播散的开始[13]. 值得注意的是，通过逆转录病毒转导MMTV-PyMT小鼠肿瘤生长产物重建GATA3表达证明足以抑制肿瘤扩散。此外，恢复GATA3诱导的乳腺导管腺癌分化[13]. 如过度表达GATA3的转基因小鼠模型所示，GATA3表达增加会延迟肿瘤生长，降低肿瘤启动能力并增加肿瘤分化[14]. 总之，这些发现突出了GATA3诱导乳腺导管腺癌功能分化和降低移植瘤细胞的肿瘤起始能力的能力。然而，沉默GATA3协议该位点不足以促进恶性进展，因为在高分化腺瘤中过早失去GATA3表达会导致细胞从基底膜上广泛脱落，继而发生凋亡[13]. 在乳腺癌患者中，GATA3的表达随着肿瘤分级的增加而稳定下降[15]一些独立的研究表明，GATA3的表达具有独立的预后价值，而GATA3表达的增加与良好的预后相关[15]-[19]. 最近的一项研究发现GATA3协议作为仅有的三个携带体细胞突变的基因之一，在mRNA表达谱定义的乳腺癌亚型中发生率超过10%[20]. 综上所述，这些研究强调了GATA3作为肿瘤抑制剂的作用。

GATA3的表达与组氨酸甲基转移酶2增强子（EZH2）之间存在功能联系，因为在基底样乳腺癌细胞中敲低EZH2可促进GATA3表达水平的增加[21]. EZH2是多梳抑制复合物2（PRC2）的催化亚单位，催化组蛋白H3（H3K27me3）的赖氨酸27的三甲基化，组蛋白标记与染色质致密化和转录抑制有关[22],[23]. 值得注意的是，Polycomb组（PcG）靶基因主要参与胚胎发育和细胞分化[24]. 怀孕期间，乳腺中EZH2表达水平、苏氨酸487（pT487-EZH2）处EZH2-磷酸化和总H3K27me3增加，与孕酮水平和PR表达增加相关。此外，PR基因敲除导致人类乳腺癌细胞系T47D中pT487-EZH2的降低[25]. 在乳腺癌中检测到EZH2的过度表达，其水平升高与较高的增殖率、肿瘤转化和更具侵袭性的癌症亚型相关[26],[27].

另一方面，细胞周期蛋白A在介导细胞周期G1向S和G2向M期的过渡中起作用，因为它是DNA复制和有丝分裂开始所必需的[28],[29]. 虽然细胞周期蛋白A1的表达仅限于生发细胞和早期胚胎的减数分裂，但细胞周期蛋白A2在增殖的体细胞中表达。细胞周期蛋白A2在乳腺癌中的潜在意义已经被提出，因为过表达细胞周期蛋白A2的转基因小鼠会产生异常的细胞核异常，提示癌前病变[30]. 此外，细胞周期蛋白A2的表达水平在乳腺癌患者中具有独立的预后价值，其表达增加与不良预后相关[31]. 因此，在设计为过度表达GATA3的MDA-MB-231乳腺癌细胞中发现细胞周期蛋白A2显著下调[32].

在本研究中，我们证明孕激素诱导的PR激活通过转录和翻译后调节促进乳腺癌细胞中GATA3表达的丢失。最后，我们还表明，孕激素诱导的GATA3下调是必需的在体外细胞增殖和体内乳腺肿瘤生长。

方法

动物和肿瘤

实验是使用在阿根廷布宜诺斯艾利斯生物医药实验研究所（IBYME）饲养的雌性BALB/c小鼠进行的。如前所述进行动物实验[33]按照美国国立卫生研究院规定的最高动物护理标准实验动物护理和使用指南[34]. 这些实验得到了IBYME动物研究委员会的批准[5]. C4HD肿瘤株表现出高水平的雌激素受体（ER）和PR。该肿瘤株不表达糖皮质激素或雄激素受体。孕激素产生持续的增殖反应在体外和体内在C4HD肿瘤模型中[35].

试剂

醋酸甲孕酮（MPA）、RU486、（Dulbecco’s）改良Eagle's培养基：火腿F12 1:1（（D）MEM）和孕酮购自Sigma Aldrich（密苏里州圣路易斯）。转染试剂Fugene HD和XtremeGENE HP（美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏生物化学公司）按照制造商的说明使用。环己酰亚胺来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），最终浓度为1μM。硼替佐米（本品®）来自Millennium Pharmaceuticals，Inc（Cambridge，MA，USA），最终浓度为100 nM；放线菌素D来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），最终浓度为5μg/ml；肉豆蔻酰化cAMP依赖性蛋白激酶抑制剂（PKI）来自Enzo Life Sciences（Exeter，UK），最终浓度为1μM。

抗体

使用了以下抗体：抗GATA3（HG3-31，sc-268）、抗细胞周期蛋白A（C-19，sc-596）、抗周期蛋白E（HE12，sc-247）、抗ER（MC-20，sc-542）和抗PR（H-190，sc-7208），来自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）；来自Abcam（马萨诸塞州剑桥市，美国）的抗pSer308-GATA3（ab61052）、抗组蛋白H3（三甲基K27）（ab6002）和抗组蛋白H1（乙酰基K9）（ab4441）；来自Neomarkers（加利福尼亚州弗里蒙特，美国）的抗PR（Ab7）、抗肌动蛋白（克隆ACTN05）和抗细胞周期蛋白D1（RB 9041-P1）；来自Cell Signaling（美国马萨诸塞州贝弗利）的抗GAPDH（D16H11）、抗磷酸化PKA底物（RRXS*/T*）（100G7E）和抗PKA C-α（4782）；来自Active Motif（Carlsbad，CA，USA）的抗EZH2（#39933）；来自Millipore（Temecula，CA，USA）的抗乙酰基-Histone H4（#06-866）；和来自Sigma的抗β-微管蛋白。

细胞培养、治疗和增殖分析

人类乳腺癌细胞系T47D是从美国类型培养收集中心（ATCC）（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的，T47D-Y细胞是霍维茨博士（美国科罗拉多州丹佛科罗拉多大学健康科学中心）慷慨捐赠的。两种细胞系均保存在（D）MEM中，补充10%胎牛血清（FCS）。在（D）MEM中对T47D细胞系进行增殖试验和处理。人类乳腺癌细胞株BT474购自ATCC，并在罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）10%FCS中保存。如前所述，对C4HD肿瘤的上皮细胞进行原代培养[5]. C4HD细胞被饥饿，并在（D）MEM中处理，补充0.1%的FCS，之前通过活性炭（chFCS）处理耗尽类固醇。用于增殖分析，1 x 10⁴这些细胞被镀在96个钢板上，可以在一夜之间附着。T47D细胞在（D）MEM或C4HD细胞在（C）MEM 0.1%chFCS或BT474细胞在（T）MEM 1%chFCS中饥饿。分别在（D）MEM或（D）EMM 0.1%chFCS中用10 nM MPA或对照溶剂（1:1000乙醇）进行24小时的治疗。细胞增殖被评估为1μCi的掺入[^三H] -如前所述，在最后18小时的孵育期间（新英格兰核电站、杜邦、波士顿、马萨诸塞州、美国；比活性20 Ci/mmol）[36]. 检测一式八份。

蛋白质斑点

裂解液是从每个实验中描述的不同处理的细胞中制备的，50μg的蛋白质通过SDS-page进行分解，如前所述[33]. 用每个实验中描述的抗体对膜进行免疫印迹。

染色质免疫沉淀

如前所述进行染色质免疫沉淀分析[6]. 用于q-PCR的底漆列于表S1中（参见附加文件1).

RNA制备和实时RT-PCR

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从T47D或C4HD细胞中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用Superscript III逆转录酶（RT）（Invitrogen）逆转录一微克RNA。引物序列详见表S1（参见附加文件1). PCR进行40个周期，在95°C下变性15秒，在60°C下退火和延伸1分钟。通过将GATA3 mRNA的绝对量标准化为用作内部对照的GAPDH mRNA水平来计算mRNA表达的倍数变化。

DNAse敏感性分析

在裂解缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 7.5；10 mM NaCl；3 mM MgCl2；0.05%NP40）中收集细胞，并在冰上培养10分钟。通过2000 rpm在4°C下离心5分钟来分离细胞核。用消化缓冲液（40 mM Tris-Cl pH 7.5；10 mM MgCl2；1 mM CaCl2）清洗颗粒，并在4°C下以2000 rpm离心5分钟。将颗粒重新悬浮在200μl中，并将每个处理分为两个管（切割和未切割作为输入控制）。样品在37°C下与DNAse I（QR1）（美国威斯康星州麦迪逊Promega）孵育5分钟。通过添加50μg蛋白酶K并在65°C下培养2小时，停止反应。通过苯酚提取和乙醇沉淀分离DNA。通过对100 ng DNA进行q-PCR来测量灵敏度，并计算为2^^{（Ctuct–Ctunct）}.

体内肿瘤生长

用结果部分详述的载体瞬时转染C4HD细胞。转染后，1 x 10⁶将细胞接种到BALB/c小鼠皮下（s.c.），小鼠在细胞接种物对面的侧面用40-mg MPA仓库处理。如前所述计算肿瘤体积。绘制每个实验组每个样本的曲线下面积，并应用单向方差分析（ANOVA）和Bonferroni后验来评估组间肿瘤生长差异的统计显著性。

质粒

pEGFP-N1空载体来自BD Biosciences-Clontech（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）。将GATA3编码为pEGFP-C1骨架内的GFP融合蛋白的表达载体是Nakayama博士（日本千叶大学医学研究生院免疫学系）的慷慨捐赠。使用表S1中详述的引物，对pEGFP-C1-GATA3进行定点突变，以产生丝氨酸308替代丙氨酸（参见附加文件1). 在阿根廷布宜诺斯艾利斯国家技术研究所（INTA）进行的DNA测序证实了该序列的成功突变。编码人野生型PR-B的质粒[37]和野生型PR-A[38]分别由Horwitz博士和Edwards博士（美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院）提供。

siRNA转染

SAB Biosciences（美国加利福尼亚州巴伦西亚）合成了靶向小鼠PR的siRNAs，Dharmacon（美国科罗拉多州拉斐特）合成了针对人类PR的siRNAs。一种不针对任何已知哺乳动物基因的siRNA被用作阴性对照。根据制造商的说明，使用DharmaFECT（Dharmacon）转染试剂转染siRNA双链体两天。所有siRNA序列如表S2所示（参见附加文件1).

体外GATA3磷酸化

为了研究内源性蛋白激酶（PKA）磷酸化GATA3的能力，用MPA处理T47D细胞8小时，在MPA处理前用PKI预处理30分钟或保持未处理。用抗PKA抗体对每个细胞处理后的1.5 mg蛋白提取物进行细胞裂解和PKA免疫沉淀。GATA3是从生长在（D）MEM中的T47D细胞的0.5 mg蛋白质中免疫沉淀而来的。免疫沉淀的GATA3受到在体外用PKAs免疫沉淀法进行磷酸化分析，该PKAs来自接受上述和中所述每种处理的细胞[39]. 样品通过SDS-PAGE进行分析。

流式细胞术

用MPA处理指定时间的T47D细胞，用胰蛋白酶收集并固定在1%多聚甲醛PBS中。为了测定GATA3丝氨酸磷酸化，用渗透缓冲液（PB）（PBS 10%FCS 0.5%皂苷）渗透细胞，并用抗pSer308-GATA3（每1 x 10个细胞中1μg抗pSer30-GATA3抗体）标记细胞⁶细胞），然后用抗兔IgG-Alexa 488培养。用同种型对照免疫球蛋白G（IgG）和抗兔IgG Alexa 488结合抗体孵育的细胞进行背景染色。用PB洗涤细胞两次，然后在室温黑暗中进行RNA消化（RNAse A 50 U/ml）和碘化丙啶（20μg/ml）染色30分钟。通过碘化丙锭含量进行细胞周期分析，并通过Alexa 488荧光测定磷酸化GATA3的表达，使用Canto II流式细胞仪进行测量（Becton–Dickinson，La Jolla，CA，USA）。采集的数据通过FlowJo v5.7.2软件进行分析。通过从用抗pSer308-GATA3抗体孵育的细胞的MFI中减去用对照同型抗体孵养的细胞的平均荧光强度（MFI），获得δ平均荧光强度值。

免疫组织化学

如前所述进行免疫组织化学[40]. 简言之，在96°C至98°C的pH值为6的10 mM柠檬酸钠缓冲液中进行20分钟的抗原回收。将载玻片与抗体部分所示的初级抗体一起孵育。随后用多检测器辣根过氧化物酶（HRP）系统（Bio SB，Santa Barbara，CA，USA）培养切片，并在3-3′-二氨基联苯胺四氯化钠中培养。

免疫荧光和共焦显微镜

将生长在玻璃盖玻片中的细胞固定并用冰镇甲醇渗透，然后用PBS 1%牛血清白蛋白（BSA）封闭细胞。使用前面描述的抗pSer308-GATA3抗体定位pSer307-GATA3，然后用抗兔IgG-Alexa 488（Molecular Probes，尤金，俄勒冈州，美国）孵育。阴性对照组使用PBS代替初级抗体。用碘化丙啶染色（5μg/ml）检测细胞核。使用尼康Eclipse E800共焦激光显微镜系统分析细胞。

结果

孕酮受体激活促进GATA3蛋白表达下调

在本研究中，我们使用了MPA诱导雌性BALB/c小鼠乳腺癌模型中C4HD上皮细胞的原代培养[33]以及PR阳性的人类乳腺癌细胞系T47D和BT474[41]. 我们的第一个目的是评估GATA3是否受PR激活的调节。我们发现MPA处理导致T47D、BT474和C4HD细胞中GATA3下调（图1A） ●●●●。通过在所有受试细胞系中预先与抗孕激素RU486孵育，可以阻止这种作用（图1A） 显示了激活GATA3下调的经典PR的要求。用增加浓度的孕酮（内源性PR配体）处理的T47D细胞显示出与MPA处理的细胞相似的GATA3下调水平（参见附加文件1：图S1）。为了进一步证明PR对孕激素介导的GATA3下调的需求，我们使用siRNAs沉默PR表达，然后进行MPA治疗。与之前的结果一致，PR敲除阻止了MPA对T47D、BT474和C4HD细胞的GATA3下调（图1B） ●●●●。因此，在来源于T47D细胞系的PR-null T47D-Y细胞中，MPA未能调节GATA3的表达（图1C） ●●●●。通过MPA治疗，PR的亚型B（PR-B）或亚型A（PR-A）的重组恢复了GATA3的调节（图1C） 表明这两种亚型都能介导MPA对GATA3表达的影响。这些结果表明，孕激素治疗后，PR介导的乳腺癌细胞GATA3表达降低。

图1

PR激活促进GATA3下调。A）T47D、BT474或C4HD细胞用或不用抗菌素RU486（10 nM）预处理30分钟，然后在指定的时间内与MPA（10 nM）混合。制备总蛋白裂解物，用western blot（WB）检测GATA3的表达。对GATA3条带进行密度测定，并将值归一化为GAPDH蛋白条带，将未处理细胞的值设置为1.0。B）用对照siRNA或siRNA靶向PR（siRNA PR）转染T47D、BT474或C4HD细胞。细胞饥饿24小时，用MPA处理指定时间，制备总蛋白裂解物，并用WB测定GATA3的表达。如A组所述，对色带进行量化。C）用MPA处理转染PR-A（T47D-YA）或PR-B（T44D-YB）亚型的T47D细胞、PR-null T47D-Y细胞或T47D-Y细胞18小时。根据面板A、MPA、醋酸甲羟孕酮中的描述对带状物进行量化；PR，孕酮受体。

孕激素通过孕激素受体和EZH2的共同募集诱导GATA3基因的转录抑制

接下来我们探讨了GATA3在转录水平下调的机制。为此，我们执行了生物信息学搜索[42]对于转录起始位点（TSS）上游5kb内的PREGATA3协议并发现推定PRE位于相对于TSS的−1504 bp至−1498 bp位置（参见附加文件1：图S2）。通过进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析，我们发现在T47D中存在MPA的情况下，PR被显著募集到潜在的PRE位点（图2A） 和BT474单元（参见附加文件1：图S3）。我们还发现H3K27me3伴随增加（图2A和附加文件1：图S3），与转录抑制相关的组蛋白修饰[22],[23]. 我们始终观察到组蛋白H3（H3K9ac）赖氨酸9的乙酰化和组蛋白H4（H4ac）的总乙酰化减少（图2A） ●●●●。由于H3K27me3是由组蛋白甲基转移酶EZH2催化的，我们测试了孕激素对EZH2-结合到位于GATA3协议发起人。事实上，在MPA处理的T47D细胞中，EZH2被显著招募到该位点（图2B） ●●●●。为了研究EZH2募集对PR与DNA结合的需求，我们使用了T47D-Y-C587A细胞系，该细胞系稳定表达PR，其含有半胱氨酸587替代丙氨酸，使受体无法与DNA结合或与其他与DNA结合转录因子结合[43]. T47D-Y-C587A的孕激素治疗未能诱导EZH2募集到假定的PRE（图2B） ，指出PR绑定到此站点的要求，以便能够在EZH2上游招募GATA3协议基因。为了进一步支持孕激素诱导的PR和EZH2与DNA的同时结合，我们进行了连续的ChIP实验，发现与对照细胞相比，孕激素处理的细胞显示出PR和EZH2对潜在PRE的联合招募显著增加（图2C） ●●●●。我们关于PR和EZH2核相互作用的结果通过共免疫沉淀实验得到了加强，表明MPA处理的细胞中PR和EZH2相互作用增加（图2D） ●●●●。由于H3K27me3与染色质致密化引起的转录抑制有关，我们接下来通过使用基因内区域GATA3协议作为灵敏度控制。我们发现，MPA处理降低了DNAse I敏感性，这与潜在PRE和TSS区域的较难接近和抑制的染色质环境一致（图2E和附加文件1：图S4）。与这些结果一致，MPA处理后观察到GATA3 mRNA水平下降，而RU486预处理阻止了T47D和C4HD细胞中的这种调节（图2F；其他文件1：图S5）。孕激素处理的T47D-Y-C587A细胞中GATA3 mRNA没有下调（图2F、 右面板），这与图中观察到的EZH2招募不足相一致2B.综上所述，这些结果表明PR介导的GATA3协议通过PR和EZH2共同募集到细胞近端PRE位点的转录抑制GATA3协议启动子，伴随着H3K27me3的增加和染色质可及性的降低，如图所示2G.公司。

图2

PR和EZH2联合招募对GATA3基因的转录抑制。A）蛋白质补充GATA3协议用ChIP分析所示处理细胞中的启动子。使用位于−1504bp位置的潜在PRE侧翼的引物，通过q-PCR扩增免疫沉淀的DNA。将每个样本归一化为输入。数据表示为同型对照的n倍染色质富集。B）按照A所述处理T47D或T47D-Y-C587A细胞并进行ChIP。C）首先用PR抗体免疫沉淀T47D细胞的染色质，然后用EZH2抗体重新免疫沉淀。还显示了反向免疫沉淀顺序。免疫沉淀DNA的q-PCR分析如A所述。D）按指示处理的T47D细胞的核提取物用PR抗体进行免疫沉淀（IP），并用EZH2抗体进行WB分析。作为特异性的控制，用同种对照物对裂解产物进行免疫沉淀。输入细胞裂解物被平行印迹。E）按照方法一节中的描述，使用附加文件中详细说明的指定引物进行DNAse敏感性分析1，表S1。F）按照指示处理T47D或T47D-Y-C587A细胞，并通过RT-qPCR测定GATA3 mRNA表达水平。通过将GATA3 mRNA的绝对水平归一化为GAPDH水平（作为内部对照），并将未处理细胞的值设置为1.0，计算MPA处理指定时间后mRNA表达水平的倍数变化。对于A、B、C和F(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001，单因素方差分析）。G）孕激素诱导GATA3转录抑制机制的示意图。方差分析；ChIP，染色质免疫沉淀；EZH2，zeste同源物2的增强子；MPA，醋酸甲羟孕酮；孕酮受体；PRE，孕酮反应元件；WB、Western blot。

孕激素通过26S蛋白酶体发挥GATA3翻译后调控

我们发现，尽管MPA不能介导T47D-Y-C587A细胞中的GATA3转录抑制（图2F） 在该细胞系中，总GATA3蛋白水平仍被MPA下调（图三A） ●●●●。这一结果表明存在额外水平的GATA3表达调控。

图3

通过26S蛋白酶体对GATA3进行翻译后调节。A）用MPA处理T47D-Y-C587A细胞18小时，制备蛋白细胞裂解物并对指示蛋白进行免疫印迹。通过密度计分析WB中GATA3条带的信号强度，将值标准化为GAPDH蛋白条带，将未处理细胞的值设置为1.0。B）在指定的时间内，用MPA和/或放线菌素D（5μg/μl）处理或不处理T47D细胞。通过将GATA3 mRNA的绝对水平归一化为GAPDH水平（作为内部对照），并将未处理细胞的值设置为1.0，计算MPA处理指定时间后mRNA表达水平的倍数变化。不显著（NS），单向方差分析。C）如图所示，无论是否使用最终浓度为1μM的环己酰亚胺（CHX）和/或最终浓度为100 nM的MPA或硼替佐米（Btz）处理T47D细胞，制备蛋白细胞裂解物，并用WB测量GATA3的表达。分析WBs中GATA3条带的信号强度，如A所示。D）T47D细胞用Btz预处理或不处理30分钟，然后按指示用MPA处理或不使用MPA处理，用RT-qPCR测定GATA3 mRNA表达，如B(***P（P）<0.001，单因素方差分析）。E）如图所示，用MPA和/或Btz处理或不处理T47D细胞，制备蛋白细胞裂解物，并用WB测定GATA3的表达。WB中GATA3带的信号强度如A.方差分析所示进行分析；MPA，醋酸甲羟孕酮；WB、Western blot。

自从有报道称GATA3 mRNA的稳定性由RNA结合蛋白调节以来[44]，我们首先研究了MPA调节GATA3 mRNA稳定性的能力。为此，我们使用了转录抑制剂放线菌素D（ActD），并测量了添加或不添加MPA时GATA3 mRNA的稳定性。孕激素治疗后，在ActD治疗的细胞中未检测到明显变化（图三B） ，排除了MPA对GATA3 mRNA稳定性的调节。

接下来，我们使用翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）分析了GATA3蛋白的稳定性。CHX抑制翻译使我们能够测量剩余GATA3蛋白相对于初始GATA3水平的稳定性。根据以前的报告[45]CHX的翻译障碍促进了GATA3蛋白在6小时内的降解。我们发现MPA治疗增加了GATA3的周转率（图三C类；车道2与车道4，密度分析显示在右侧面板中）。此前的研究表明GATA3 26S蛋白酶体介导的免疫系统细胞降解[46]，我们假设26S蛋白酶体可能参与MPA介导的乳腺癌细胞GATA3降解。为了解决GATA3稳定性是否以26S蛋白酶体依赖的方式调节，我们用CHX和26S蛋白酶体药用抑制剂硼替佐米（Btz）联合处理细胞。26S蛋白酶体功能受损导致在孕激素存在下阻止GATA3蛋白降解（图三C类；车道4和5与车道6和7）。这一结果表明，MPA降低GATA3蛋白水平需要26S蛋白酶体活性。先前的研究表明，PR转录活性依赖于26S蛋白酶体功能[47]. 因此，我们推测PR介导的GATA3阻遏可以通过抑制26S蛋白酶体活性在转录和翻译后水平上被阻止。事实上，与Btz孵育可防止MPA处理后GATA3在mRNA上的下调（图三D） T47D和C4HD细胞中的蛋白质水平（图三E和附加文件1：图S6）。这些结果表明，一方面，孕激素以翻译后方式调节GATA3蛋白水平，另一方面，抑制26S蛋白酶体活性可防止MPA介导的GATA3在转录和翻译后水平下调。

丝氨酸308处的GATA3磷酸化调节蛋白质稳定性

接下来，我们讨论了MPA是否诱导丝氨酸308（pSer308-GATA3）的GATA3磷酸化，丝氨酸308位于cAMP依赖性PKA共有位点内，已被证明是PKA靶点在体外[48]. 共焦显微镜实验显示，经MPA处理的T47D细胞中磷酸化PKA底物增加，与肉豆蔻酰化PKA抑制剂（PKI）孵育可以阻止这种作用（参见附加文件1：图S7）。通过与抗pSer308-GATA3抗体孵育，然后与Alexa 488-结合二级抗体孵育来证明孕激素治疗后pSer308-GATA3阳性细胞的增加（图4A） ●●●●。pSer308-GATA3抗体的特异性通过与总GATA3共定位和GATA3敲低导致的信号损失来验证（见附加文件1：图S8）。MPA和PKI共培养阻止了MPA诱导的GATA3磷酸化，pSer308-GATA3阳性细胞的减少证明了这一点（图4右面板），显示了MPA在丝氨酸308处对GATA3磷酸化的PKA激活要求。为了直接评估PKA是否可以诱导pSer308-GATA3的磷酸化，免疫沉淀的GATA3受到寒冷在体外磷酸化分析如方法部分所述。MPA-激活的PKA诱导pSer308-GATA3，当用PKI预处理细胞时，其被阻断（图4B） ●●●●。

图4

GATA3磷酸化调节蛋白质稳定性。A）用MPA和PKA抑制剂PKI（1μM）处理或不处理T47D细胞8小时。细胞核用碘化丙啶染色，并进行共焦显微镜分析。比例尺 = 10微米。右侧面板：在A中进行的治疗中pSer308-GATA3阳性细胞的量化。对于每个治疗中至少150个细胞（N = 6) (**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，单因素方差分析）。B）PKA诱导pSer308-GATA3在体外对按指示处理的T47D细胞进行裂解，并从每个细胞处理的蛋白提取物中免疫沉淀PKA。在（D）MEM中生长的T47D细胞免疫沉淀GATA3。免疫沉淀的GATA3受到感冒在体外方法一节中所述的磷酰化分析。C）通过碘化丙啶染色确定的细胞周期不同阶段pSer308-GATA3的共焦显微镜图像。比例尺 = 10微米。右侧面板上的条形图表示由DNA含量确定的细胞周期不同阶段的pSer308-GATA3平均荧光强度（MFI）的流式细胞术分析(***P（P）<0.001，学生t吨-测试）。D）T47D细胞用CHX和/或MPA或H89（1μM）处理指定时间。WBs的GATA3条带进行了密度测定，并将值归一化为GAPDH蛋白条带，将未处理细胞的值设置为1.0。结果以线形图表示。E）用所示载体转染细胞48小时，饥饿24小时，并按所示处理。WB的密度分析如D所示。F）在E中转染细胞，在D中进行密度分析。G）孕激素对GATA3翻译后调节的建议模型。方差分析；CHX，环己酰亚胺；MPA，甲羟孕酮乙酸酯；蛋白激酶；WB、Western blot。

另一方面，26S蛋白酶体对PR的下调是其转录多动所必需的[49]. 证明26S蛋白酶体的抑制由于蛋白酶体的作用阻止了GATA3的降解就其本身而言我们评估了Btz对GATA3磷酸化的影响。共聚焦显微镜分析表明，pSer308-GATA3是在Btz存在下诱导的，这表明26S蛋白酶体阻断不会影响MPA诱导的pSer308-GATA3增加（参见附加文件1：图S9）。

值得注意的是，pSer308-GATA3阳性的细胞正在经历有丝分裂，如碘化丙啶染色质染色所示（图4C） ●●●●。流式细胞术分析证实了这一观察结果，显示MPA处理的细胞在细胞周期S期和G2期的pSer308-GATA3水平高于G1期的细胞（图4C、 右侧面板）。MPA诱导的pSer308-GATA3也被观察到与DNA含量有关（参见附加文件1：图S10）。接下来，我们讨论了丝氨酸308处GATA3磷酸化与GATA3蛋白稳定性的相关性。为此，我们用PKA抑制剂H89处理T47D细胞，并通过在有或无MPA的情况下用CHX处理来测量GATA3蛋白周转。密度分析表明，PKA抑制将GATA3蛋白的稳定性恢复到与CHX单独处理细胞相似的水平（图4D类；密度分析如右图所示）。为了进一步支持丝氨酸308处GATA3磷酸化对蛋白质稳定性的重要性，我们在编码GFP-融合野生型蛋白（GFP-GATA3-WT）的载体中，在308位（一种非磷酸化氨基酸）生成了丝氨酸-丙氨酸替代物（GFP-GATA3-S308A）。这里，我们通过WB分析显示，转染GFP-GATA3-S308A并用CHX处理的细胞显示，与野生型对应物相比，GFP-GACA3-S308A蛋白的稳定性增加，即使存在孕激素（图4E；密度分析如右图所示）。此外，转染实验表明，尽管MPA处理促进了内源性GATA3和GFP-GATA3-WT蛋白的下调，但它无法在类似程度上下调GFP-GATA 3-S308A突变蛋白（图4F） ●●●●。由于组成型启动子驱动外源性GATA3表达，该实验一方面验证了MPA介导的GATA3翻译后下调，另一方面证明了丝氨酸308处磷酸化对增加GATA3蛋白周转的需求。上述结果将丝氨酸308处的GATA3磷酸化与蛋白质稳定性联系起来，并证明了实现MPA诱导的GATA2蛋白质降解需要GATA3的磷酸化。所述机构的示意图如图所示（图4G） ●●●●。

孕激素诱导的细胞增殖和细胞周期蛋白A2水平升高需要GATA3下调

孕激素刺激在体外和体内乳腺癌是公认的[33],[50]. 鉴于目前的结果显示，在细胞周期进展期间，GATA3在丝氨酸308中磷酸化（图4C） 并且这种磷酸化的损伤阻止了MPA对GATA3的下调（图4F） ，我们接下来研究了GATA3下调与孕激素诱导的相关性在体外扩散和体内肿瘤生长。为了评估GATA3过度表达对细胞增殖的影响，我们用GFP-GATA3-WT或GFP-GACA3-S308A转染T47D细胞，并使用[^三H] -胸腺嘧啶掺入作为细胞增殖的测量。转染GFP-GATA3-WT载体可削弱MPA诱导的T47D、C4HD和BT474细胞增殖（图5A和附加文件1：图S11）显示增加的GATA3水平可防止MPA诱导的增殖。我们观察到，与GFP-GATA3-WT相比，转染突变形式GFP-GATA 3-S308A导致显著增强的增殖抑制（图5A） ●●●●。这些结果与之前观察到的GFP-GATA3-S308A突变蛋白在孕激素存在下稳定性增加一致（图4F） 并显示GATA3下调MPA诱导的细胞增殖的要求。

图5

孕激素诱导的细胞增殖和细胞周期蛋白A2水平升高需要GATA3下调。A）用所示载体转染T47D细胞48小时，并按照方法部分所述测量细胞增殖。不显著（NS）(***P（P）<0.001，单因素方差分析）。B）用MPA处理细胞指定时间，制备蛋白裂解物并对指定蛋白进行免疫印迹。通过将细胞周期蛋白A归一化为GAPDH蛋白带并将未处理细胞的值设置为1.0，获得密度测定值。C）用所示载体转染细胞48小时，饥饿24小时，并按所示处理。制备蛋白裂解物并对所示蛋白进行免疫印迹。根据面板B的描述对条带进行量化。方差分析；MPA，醋酸甲羟孕酮。

对一个公开可用的微阵列数据集的分析表明，cyclin A2是MDA-MB-231乳腺癌细胞中GATA3过度表达后cyclin家族中唯一显著下调的成员[32]（参见附加文件1：图S12）。我们发现黄体酮治疗12小时和18小时时，细胞周期蛋白A2表达水平增加（图5B） ●●●●。此外，转染GFP-GATA-WT或GFP-GACA3-S308A可阻止MPA处理的T47D细胞中细胞周期蛋白A2的上调（图5C） ●●●●。与以前的报告一致[32]，用GFP-GATA3-WT载体转染MDA-MB-231细胞时，细胞周期蛋白A2水平也降低（参见附加文件1：图S13）。然后我们讨论了GATA3过表达在体内肿瘤生长。为此，10⁶将先前转染GFP控制载体GFP-GATA3-WT或GFP-GACA3-S308A表达载体的C4HD细胞皮下接种到经MPA治疗或未经MPA处理的BALB/c小鼠中，并测量肿瘤生长。如前所述，C4HD肿瘤生长表现出孕激素依赖性行为[36]，因为缺乏MPA颗粒导致GFP转染细胞中肿瘤生长不足，并且接种MPA颗粒诱导肿瘤生长（图6A） ●●●●。GFP-GATA3-WT过度表达显著降低了孕激素依赖性肿瘤的生长，并且这种作用在GFP-GATA 3-S308A肿瘤中显著增强（图6A） ●●●●。与GFP或GATA3-WT肿瘤相比，GFP-GATA3-S308A肿瘤中检测到细胞周期蛋白A2水平降低，而各治疗组的细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E水平相似（图6B） ●●●●。免疫组化研究的肿瘤样本中cyclin A2的表达水平与WB的结果一致，GFP-GATA3-S308A肿瘤中cyclin A2的表达降低（图6C） ●●●●。综上所述，这些结果说明了GATA3通过阻止细胞周期蛋白A2上调而作为MPA诱导细胞增殖的负调控因子的作用，并证明了GATA3协议孕激素驱动的乳腺癌生长的下调。

图6

孕激素诱导的GATA3下调是必需的 体内 肿瘤生长。A）C4HD电池（10⁶)将每个实验组的小鼠皮下接种到经或未经MPA处理的雌性BALB/c小鼠（n = 每个实验组6个），并使用公式W计算肿瘤体积²x L/2，其中W = 宽度和L = 长度。箱线图表示每个实验组获得的生长曲线下面积的值(***P（P）<0.001和**P（P）<0.01，单因素方差分析）。B）从肿瘤样品中制备蛋白质提取物，并对所示蛋白质进行免疫印迹。C）GFP、GFP-GATA3-WT和GFP-GACA3-S308A C4HD肿瘤中细胞周期蛋白A2的免疫组织化学研究。使用正常人乳腺组织作为阴性对照（下面板）。显示了每个实验组的代表性图像。比例尺 = 20微米。方差分析；MPA，醋酸甲羟孕酮。

讨论

孕酮受体介导的转录抑制

转录抑制是细胞过程调控的关键步骤。在目前的工作中，我们确定了一个假定的PRE位点，该位点位于相对于TSS的-1504 bp位置GATA3协议我们还证明PR参与该基因的转录抑制。我们强调了GATA3协议抑制PR诱导的细胞增殖，并描述了PR联合招募EZH2的能力，EZH2-PRC2的催化亚单位到潜在的PRE位点GATA3协议近端启动子。这种招募导致H3K27me3增加、染色质致密化和转录抑制。我们还表明，孕激素治疗促进H3K9ac和H4ac的减少，这表明在GATA3协议抑制，如组蛋白去乙酰化酶的募集。值得注意的是，我们在这里表明孕激素激活PR会诱导PR和EZH2之间的相互作用，这表明该机制可能与其他PR靶基因的抑制有关。进一步的研究可以为PR和EZH2之间组装抑制剂的设计提供有价值的工具，这些抑制剂可能具有治疗价值。

PcG通过抑制靶基因在细胞分化中的作用是众所周知的。孕酮对乳腺中EZH2的调节[25]提示其活性可能与激素受体的作用有关。因此，EZH2可能通过激素提示被定向到靶基因的子集。通过PR和EZH2联合招募调节主转录因子GATA3与报道的PcG通过调节参与细胞分化的基因在细胞命运转换中的作用一致[24]与GATA3的情况一样。利用全基因组方法确定正常乳腺和乳腺癌细胞中PR和EZH2结合的位点是有意义的，这可能允许以EZH2-依赖的方式识别PR抑制的靶基因。如果这里描述的转录抑制GATA3协议该位点被证明是PR介导的靶基因抑制的一般机制，它可以通过阻断抑癌基因的抑制和促进乳腺癌细胞的分化状态，为使用EZH2抑制剂预防PR驱动的乳腺癌进展奠定基础。

GATA3对细胞周期蛋白A2的调节

细胞周期转换由细胞周期素依赖性激酶（CDK）控制，其活性取决于在细胞周期进展过程中与具有独特表达模式的特定细胞周期素的相互作用。特别是，cyclin D1的表达在细胞周期的G1期达到峰值，并与Cdk2、Cdk4和Cdk6相互作用，促进细胞周期G1期的进展。此外，细胞周期蛋白A2在增殖的体细胞中表达，其表达在细胞周期的S和G2期达到高峰，因为它介导DNA复制的开始，因此也介导细胞周期从G1期向S期的转变[28]. 这里的结果表明，GATA3阻断MPA诱导的增殖可能涉及直接的细胞周期蛋白A2转录抑制。GATA3在乳腺腔细胞命运中的密切参与有利于GATA3调节细胞周期进展的可能性。事实上，一些报道证明了GATA3对在细胞周期控制中具有关键功能的因子的转录调控，例如p18（ink4c）[51],[52]和细胞周期蛋白D1[53],[54]其中GATA3与各自发起人中的反应元件相结合。值得注意的是，人类细胞周期蛋白A2近端启动子包含三个GATA3结合位点，其中两个串联位于-171 bp位置，另一个定位于-2496 bp位置[42]. 需要进一步的研究来评估GATA3是否单独或作为增强体的一部分被招募到这些结合位点来抑制MPA诱导的细胞周期蛋白A2转录。

一方面，据报道，细胞周期蛋白D1的表达需要GATA3[54]另一方面，我们在这里表明，孕激素诱导的细胞周期蛋白A2水平需要GATA3下调。值得注意的是，在S/G2诱导GATA3在Ser 308的MPA磷酸化，这表明这一事件可能先于孕激素增加细胞周期蛋白A2。这些结果表明，GATA3可能协调这两种细胞周期蛋白的表达。我们目前在转录和翻译后水平上对GATA3调控的证明可能表明了其表达的时间协调对于同步细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白A2的表达模式的重要性。此处描述的GATA3下调的两种独立机制可能对GATA3表达提供微调。进一步了解GATA3在协调细胞周期进展中的作用可能有助于阐明其在乳腺癌中的作用。

GATA3磷酸化作为潜在预后标志物的相关性

几项研究表明，GATA3的表达对乳腺癌患者的预后具有独立的预测价值[15]-[17],[19]. 在本研究中，我们展示了丝氨酸308处GATA3磷酸化在PR诱导的GATA3蛋白周转中的作用。我们还表明，与野生型对应物相比，非磷酸化突变GFP-GATA3-S308A阻止MPA诱导的乳腺癌细胞增殖的能力增强，如体内在C4HD临床前模型中进行检测。鉴于目前的结果建立了GATA3磷酸化和蛋白质周转增加之间的联系，我们建议在乳腺癌患者中测定pSer308-GATA3水平可以预测GATA3的丢失。pSer308-GATA3的检测可以对GATA3阳性肿瘤进行分层，并识别那些预计会失去GATA3表达的肿瘤，这将导致更糟糕的预后。后一组患者可受益于抗孕激素治疗，以防止GATA3降解，从而防止孕激素诱导的肿瘤生长。

结论

这项研究的结果表明，孕激素通过受体上游的PR结合下调GATA3转录物GATA3协议基因、EZH2募集和染色质致密化。我们还表明，PR激活导致PKA介导的GATA3在丝氨酸308处磷酸化，从而导致26S蛋白酶体介导的GATA3蛋白降解。最后，我们证明了GATA3下调对细胞周期蛋白A2上调和孕激素驱动的乳腺癌生长至关重要。