EZH2是侵袭性乳腺癌的标志物，促进乳腺上皮细胞的肿瘤转化

摘要

乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因，在美国每年约有40000人死于乳腺癌(1). 尽管乳腺癌的早期检测和治疗取得了进展，但20%的复发和/或转移患者的死亡率≈100%(2). 目前，临床上使用的乳腺癌患者最重要的预后标志物是分期系统的组成部分，如原发肿瘤大小和淋巴结转移的存在(三). 然而，这些传统指标的准确性没有预期的那么精确，导致系统治疗的应用效率低下(4). 因此，需要在诊断时对肿瘤行为进行新的分子预测，以帮助指导临床治疗决策。

很少有乳腺癌进展的生物标记物被证明具有临床用途(4). 雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）是乳腺癌患者的高度预测因子，将受益于内分泌治疗(5)但都是微弱的预后因素(6). 其他用于预测乳腺癌的肿瘤标记物包括erbB2扩增/过度表达、组织蛋白酶D和uPAR(4). 然而，共识仍然是需要更精确和可靠的新预测因素(7).

通过我们的基因表达谱研究，我们确定EZH2在转移性前列腺癌中过度表达(8). 在临床局限性前列腺癌中，EZH2被发现可以预测前列腺切除术后的不良结果（即生化复发或转移）。EZH2是一种多囊群（PcG）蛋白，与果蝇属Zeste增强子与基因沉默(9,10). 推测PcG蛋白在控制细胞的转录记忆中起作用(9). 这种基因沉默机制的失调可能导致癌症(9,11,12). 在前列腺癌的背景下，我们提供了证据表明EZH2作为转录阻遏物发挥作用，并且抑制EZH2阻止前列腺细胞生长(8). 有趣的是，最近的几项研究表明EZH2具有酶活性，并作为组蛋白H3甲基转移酶发挥作用(13–15).

生化分析表明，PcG蛋白属于至少两种多聚体复合物，PRC1(16)和EED-EZH2（Enx1）(17). 这些复合物被认为通过作用于染色质结构水平而遗传沉默基因。EED蛋白与哺乳动物细胞中的1型组蛋白脱乙酰酶（HDAC）直接相互作用(18)中的、和果蝇属(19)，这被认为是沉默机制的一部分。此外，最近的研究表明EED/EZH2复合物甲基化H3-K9和K27在体外，强烈偏好K27(13–15). H3-K9的甲基化(20)H3-K27被认为参与将PRC1复合物靶向特定的遗传靶位点。

通过询问公开可用的基因表达数据集，我们确定EZH2在乳腺癌中失调。在本研究中，我们检测了正常乳腺和乳腺癌进展中EZH2 mRNA转录和蛋白水平。对乳腺癌标本进行的免疫组织化学分析表明，高EZH2水平与乳腺癌患者的不良临床结局密切相关。EZH2是乳腺癌复发和死亡的独立预测因子，提供了超出已知临床、病理和生物标记物研究范围的预后信息。EZH2在正常乳腺上皮细胞系中的过度表达产生了以凤尾鱼非依赖性生长和细胞侵袭为特征的肿瘤表型。EZH2介导的肿瘤转化依赖于SET结构域和HDAC活性。重要的是，我们提出了EZH2与肿瘤侵袭性关联的生物学基础，因为高水平的EZH2-促进肿瘤的侵袭潜能。

方法

患者选择和组织芯片开发。用于组织微阵列构建的乳腺组织取自密歇根大学的外科病理学文件，并获得了机构审查委员会的批准。共280例(n个=917个组织微阵列样本）由研究病理学家（C.G.K.）审查，并按所述排列成三个高密度组织微阵列(21,22). 请参见支持方法作为支持信息发布在PNAS网站上，网址：www.pnas.org，以了解详细信息。

免疫组织化学研究。使用标准生物素-亲和素复合物技术和先前通过免疫印迹分析验证的EZH2多克隆抗体对组织微阵列（TMA）进行免疫组织化学(8). 请参见支持方法详细方法。通过使用详细描述和验证的程序，对TMA进行ER和PR以及HER-2/neu的免疫染色(23). 请参见支持方法了解详细信息。

统计分析。正常乳腺、增生和导管癌EZH2染色强度的比较就地通过计算每个病例的中位数染色强度并应用Wilcoxon秩检验，对浸润癌和转移癌进行检测。A类P（P）<0.05的值被认为是显著的。计算从原发肿瘤手术切除日期到死亡日期的总生存率。分析中包括死于或患有该疾病的患者。对于疾病特异性存活率，在死亡时对死于其他原因的患者的数据进行审查。采用Kaplan–Meier方法构建总生存率和疾病特异性生存率曲线。治疗失败的临床标准是局部复发和/或转移灶的发展。

采用双侧log-rank检验对疾病特异性生存率进行单因素分析，以评估EZH2蛋白表达、年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、分期、血管淋巴浸润、ER状态、PR状态和HER-2/neu状态。为了同时评估多个变量的影响，通过逐步删除非重要参数，建立了统计显著协变量的多变量Cox比例风险模型。通过Wald检验确定Cox模型的统计显著性。

SYBR绿色定量实时PCR。我们对19份激光显微切割冷冻乳腺组织进行了SYBR绿色实时定量PCR分析，这些冷冻乳腺组织来自我们机构的冷冻乳腺组织库，获得了机构审查委员会的批准。请参见支持方法了解详细信息。

免疫印迹分析。从正常和癌变乳腺组织中制备蛋白质提取物，并进行标准免疫印迹分析。请参见支持方法了解详细信息。

腺病毒构建。腺病毒构建物由在体外重组。简言之，将全长EZH2或SET结构域缺失的EZH2（EZH2-ΔSET）插入腺病毒穿梭质粒[pACCMVpLpA（-）loxP-SSP]。通过转染293互补细胞系产生病毒。病毒在911细胞中繁殖并在CsCl梯度上纯化。计算感染的倍数，并将纯化的病毒保存在10 mM Tris·HCl（pH 7.4）/137 mM NaCl/5 mM KCl/1 mM MgCl2的10%甘油中（按体积计）。

细胞计数。H16N2感染EZH2腺病毒。细胞计数通过胰蛋白酶化细胞进行估算，并在指定的时间点通过Coulter计数器进行分析，一式三份。

软琼脂分析。在六孔培养板中，在正常培养基中制备0.6%（wt/vol）的低熔点琼脂糖底层。顶部是一层0.6%的琼脂糖，含有1×10⁵放置稳定的转染细胞(24). 25天后，用P-碘四氮唑紫对病灶进行染色并计数。

HDAC分析。HDAC活性分析根据制造商的说明进行（Biomol，普利茅斯会议，PA）。请参见支持方法了解详细信息。

基底膜基质侵入试验。用载体EZH2和EZH2-ΔSET腺病毒感染细胞。感染后48小时，在存在或不存在HDAC抑制剂亚甲酰苯胺羟肟酸（SAHA）（7.5μM）和曲古菌素A（TSA）（0.5μM）的情况下，将细胞胰蛋白酶化并等量接种到基底膜基质24孔培养板[细胞外膜（ECM）；Chemicon]上。FBS被添加到下室中作为化学引诱剂。培养48小时后，用棉签轻轻去除非侵入细胞和ECM。对位于腔室下侧的受侵细胞进行染色、风干并拍照。在显微镜下对入侵细胞进行计数。对于比色分析，用150μl 10%乙酸处理插入物，并在560 nm处测量吸光度。

海胆（SU）胚胎基底膜侵入试验。H16N2细胞感染载体EZH2和EZH2-ΔSET腺病毒，48 h后进行胰蛋白酶消化(25). 请参见支持方法了解详细信息。

鸡绒毛尿囊膜（CAM）侵入试验。EZH2和对照病毒感染的H16N2细胞用48 nm直径的氟硅石羧基化聚苯乙烯纳米球（Polysciences）进行标记，如所述(26). 请参见支持方法了解详细信息。

结果

乳腺癌中EZH2转录和蛋白表达升高。在我们先前研究前列腺癌中EZH2特征的基础上(8)，我们有兴趣确定EZH2在乳腺癌中是否失调，乳腺癌与前列腺癌类似，是类固醇激素调节的。我们小组正在努力创建一个癌症微阵列元分析数据库（参见网址：www.ONCOMINE.org)源于我们对前列腺的初步研究(27). 在五个公开的乳腺癌基因表达数据集中(28–32)，只有佩罗等。(28)这项研究使用肿瘤组织和正常乳腺组织来比较良性和恶性乳腺组织。有趣的是，在这个数据集中，我们发现EZH2转录物在浸润性乳腺癌和转移性乳腺癌中相对于正常乳腺癌显著过度表达(P（P）= 0.002,t吨测试）(28).

为了验证这些DNA微阵列结果，我们对19例激光捕获显微切割的正常和侵袭性乳腺癌进行了SYBR绿色定量实时PCR。正如预测的那样，与正常乳腺上皮细胞相比，浸润性癌中EZH2 mRNA的水平平均增加了7.5倍(t吨测试，P（P）= 0.0085) (图1一). 为了证实侵袭性乳腺癌中EZH2在蛋白水平上升高，我们通过免疫印迹分析分析了正常乳腺和乳腺癌组织提取物。与转录数据一致，浸润性乳腺癌表达的EZH2蛋白水平高于正常乳腺癌(图1b条). 重要的是，EED，一种与EZH2形成复合物的PcG蛋白，没有表现出类似的蛋白质失调。

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图1。

乳腺癌中EZH2 mRNA转录和蛋白水平升高。(一)激光捕获显微切割正常和乳腺癌上皮中EZH2转录物的定量SYBR绿色RT-PCR。每个样品重复进行，并计算与管家基因羟甲基双胺合酶（HMBS）相关的比率。(b条)乳腺组织提取物中EZH2和EED的免疫印迹分析。转移性前列腺癌作为阳性对照。β-管蛋白作为负荷对照。(c（c）)用EZH2抗体染色的代表性乳腺组织切片。(左侧)正常乳腺上皮（开口三角形）和邻近血管内乳腺癌栓子（填充三角形）。(居中)一种高EZH2水平的侵袭性乳腺癌。(赖特)一种低EZH2水平的侵袭性乳腺癌。(d日)乳腺癌进展中EZH2表达的组织芯片分析。肿瘤标本被分层为高EZH2表达（填充条，得分3或4）和低EZH2表达（开放条，得分1或2）。这个年axis表示每类患者的百分比。

接下来，我们使用高密度组织芯片评估了EZH2蛋白在多种乳腺组织中的表达（280例患者，n个=917个样本），以表征其表达就地通过免疫组织化学。EZH2蛋白主要在细胞核中表达(图1c（c）)，如前所述(33). 表达高水平EZH2（得分3-4，EZH2+）和低水平EZH2（得分1-2，EZH2-）的侵袭性乳腺癌很明显(图1c（c） 居中和赖特). 形成血管内栓塞的肿瘤细胞与邻近的正常乳腺上皮细胞之间存在显著的染色差异(图1c（c） 左侧). 与我们的mRNA转录数据一致，相对于正常或非典型增生，浸润性癌中EZH2蛋白水平升高（Wilcoxon试验，P（P）< 0.0001,图1d日). 如转移性前列腺癌(8)，乳腺癌转移灶表达高水平的EZH2(图1d日). 正常、不典型增生和导管癌的中位EZH2染色强度就地（DCIS）、浸润性癌和转移分别为1.47（SE 0.61）、2（SE 0）、2.38（SE 0.52）、2.74（SE 0.99）和3.09（SE 1.04）(图1d日). 有趣的是，浸润性癌的前体DCIS中已经存在增加的EZH2蛋白和转录物(图1d日).

EZH2对乳腺癌的预后价值。为了研究EZH2 mRNA表达水平是否与预后相关，我们分析了已发表的van t Veer等。(30)乳腺癌基因表达数据集，包含78例淋巴结阴性、小于5cm的散发浸润性癌的结果信息。我们发现，与未转移的浸润性癌相比，在最初诊断后5年内转移的浸润癌中EZH2转录表达水平显著升高（Wilcoxon秩检验P（P）= 0.01,图2一). 通过Kaplan–Meier分析，EZH2的高表达[>1.26（log10比率>0.1）]与初诊后5年内发生转移显著相关（log秩P（P）<0.0001）。多变量Cox危险回归分析表明，EZH2 mRNA表达是转移发展的独立预测因子，危险比为2.02（95%可信区间1.08–3.76，P（P）= 0.03).

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图2。

高EZH2水平与侵袭性乳腺癌相关。(一)根据van’t Veer用DNA微阵列测量的EZH2 mRNA转录水平对无转移生存率进行Kaplan–Meier分析等。(30). Kaplan–Meier疾病特异性分析(b条)和整体(c（c）)通过免疫组织化学分析评估EZH2蛋白水平的存活率。患者根据高（+）或低（-）EZH2表达水平分组。P（P）使用log-rank检验计算值。

通过使用我们的乳腺癌组织芯片数据，我们能够评估乳腺癌中EZH2蛋白水平的临床和病理相关性。在我们连续236名乳腺癌患者的队列中(n个=712个样本），194人有完整的随访信息。患者的临床病理特征见表1研究人群的中位年龄为56岁（26至89岁）。经过中位数3.2年的随访（17天至15.8年），194名患者中有42名（21.6%）死于乳腺癌。整个队列患者的5年和10年特定疾病生存率分别为60.28%和38.66%。EZH2蛋白水平与临床特征之间的关系如表3所示，该表在PNAS网站上作为支持信息发布。EZH2的表达与临床结果的标准病理学预测因子密切相关，包括肿瘤直径(P（P）=0.002）和疾病阶段(P（P）<0.0001）。较高的EZH2水平也与年龄下降显著相关(P（P）=0.0003），ER状态为阴性(P（P）=0.0001），负PR状态(P（P）<0.0001）和淋巴结状态(P（P）=0.001），但不是HER2/neu过度表达。根据EZH2状态，复发或转移的危险比为2.92(P（P）< 0.0001).

单变量分析的结果如表4所示，该表作为支持信息发布在PNAS网站上。正如预期的那样，在单变量水平上，淋巴结状态、肿瘤直径和疾病分期与疾病特异性和总生存率相关。激素受体状态与预后呈负相关。我们发现EZH2蛋白水平与患者预后之间存在密切联系。较高的EZH2蛋白水平与初次手术治疗后无病间隔时间缩短、总体生存率降低以及疾病特异性死亡（或乳腺癌死亡）的高概率相关(图2b条和c（c）). 高EZH2表达肿瘤患者的10年无病生存率为24.76%，而低EZH2-表达肿瘤患者为58.92%（对数秩P（P）< 0.0001,图2b条). 在淋巴结阴性疾病患者中，EZH2的高表达与疾病特异性生存相关（对数秩P（P）= 0.007). EZH2表达与I期和II期疾病患者的疾病特异性生存率相关（对数秩，P（P）=0.037和P（P）分别=0.048），但在晚期（III期和IV期）患者中没有。EZH2与淋巴结阳性患者的生存率无关。EZH2蛋白高表达与ER阴性状态之间的强烈反向关联（Kruskal–Wallis检验，P（P）=0.001，表3）促使我们调查EZH2的预后效用是否取决于ER状态。Kaplan–Meier分析表明，EZH2水平与ER阳性和阴性浸润性癌的预后密切相关（见图5，其作为支持信息发布在PNAS网站上）。因此，我们的数据表明EZH2具有独立于ER状态的预后效用。

预测疾病特异性生存的最佳多变量模型包括阳性淋巴结、高EZH2表达和阴性PR状态(表2). EZH2高表达是一个强有力的独立预后预测因子，提供了比其他独立预后特征更重要的生存信息，其危险比为2.04，95%可信区间为1.17-3.57，P（P）= 0.01. 肿瘤大小、血管淋巴管浸润和ER状态与EZH2在单变量水平上有很强的相关性，但在多变量水平上与预后无关。

EZH2过度表达促进正常乳腺上皮细胞锚定非依赖性生长和HDAC活性。为了研究乳腺上皮细胞中EZH2表达失调的功能，我们构建了表达EZH2.的腺病毒载体。我们还生成了一种腺病毒，表达了一种突变型EZH2，其中C末端SET结构域被截断（EZH2-ΔSET）。正常永生乳腺上皮细胞（H16N2）(34)感染了表达EZH2和EZH2-ΔSET的病毒，并且在图3一在组织培养中，乳腺上皮细胞中EZH2的过度表达并没有显著促进细胞增殖(图3b条). 有趣的是，相对于EZH2ΔSET和载体对照，EZH2-过表达显著促进了软琼脂中的菌落形成(图3c（c）和d日). 事实上，菌落只存在于EZH2感染的H16N2细胞中，这支持了EZH2可以促进凤尾鱼非依赖性生长的观点。正如我们之前对前列腺细胞的研究一样(8)，乳腺癌细胞中EZH2的过度表达诱导了一组靶基因的转录抑制（数据未显示）。先前的研究表明EED–EZH2复合物招募I型HDAC(18). 为了确定EZH2的过度表达是否调节HDAC，我们测量了乳腺上皮细胞裂解物中的HDAC酶活性。过度表达EZH2而非EZH2-ΔSET突变体增加了乳腺上皮细胞的总HDAC活性。在HDAC抑制剂TSA存在的情况下，这种活性被完全消除。

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图3。

EZH2介导的锚定非依赖性生长。(一)感染编码EZH2或EZH2-ΔSET突变体腺病毒的乳腺细胞株H16N2的免疫印迹分析。(b条)EZH2的异位过表达不会显著增强培养物中乳腺上皮细胞的生长。用EZH2腺病毒和对照感染H16N2细胞，并在指定的时间点对细胞进行计数。以LacZ腺病毒和载体腺病毒为对照。(c（c）)EZH2表达增强凤尾鱼非依赖性生长在体外H16N2细胞感染EZH2、EZH2-ΔSET或载体腺病毒。通过在软琼脂中分析菌落形成来测定锚定非依赖性生长，如方法25天后，对盘子进行染色并拍照。(d日)软琼脂菌落的定量c（c）。针对每种情况，对三口井的菌落进行了定量。(e（电子）)EZH2诱导乳腺上皮细胞的HDAC活性。用TSA（1.0μM）处理感染指示病毒的H16N2细胞的提取物，测量HDAC活性。如制造商（Biomol）所示，使用HeLa细胞的核提取物作为阳性对照。提取物2的HDAC活性是提取物1的2倍。AFU，任意荧光单位。

失调的EZH2调节乳腺上皮细胞的侵袭潜能。接下来，我们评估了EZH2在癌细胞侵袭方面的生物学功能。在重组基底膜侵袭室试验中，我们观察到乳腺上皮细胞中EZH2的过度表达促进了侵袭(图4一和b条). 包括EZH2ΔSET突变体和载体的对照实验没有表现出类似的促侵袭特性。重要的是，通过加入HDAC抑制剂TSA和SAHA，EZH2介导的侵袭减弱。细胞侵袭通过细胞计数和比色法进行定量(图4b条). 接下来，我们使用SU-ECM(25,35)以检测表达EZH2的乳腺上皮细胞的侵袭特性。SU-ECM分析比重建基底膜分析具有优势，因为它是一种均匀的、生物性的、无血清的基底膜，与细胞遇到的细胞外基质类型非常相似体内与重建基底膜分析一样，SU-ECM分析中EZH2的过度表达支持了关于EZH2的侵袭潜能及其对HDAC活性的要求的类似发现(图4c（c）).

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图4。

EZH2参与细胞侵袭在体外和体内(一)采用重组基膜侵入室试验（Chemicon）评估感染EZH2的乳腺上皮细胞系并控制腺病毒。显示了入侵和染色细胞的代表性区域。(b条)在六个字段中计算入侵细胞的数量，并确定平均值。比色法定量（560nm处的吸光度）显示在插入(c（c）)EZH2介导的SU-ECM侵袭。H16N2细胞感染EZH2、EZH2-ΔSET或对照腺病毒。(d日)在CAM分析中，EZH2过度表达介导乳腺上皮细胞的侵袭。(上部)CAM组织用苏木精/伊红染色。箭头表示侵入CAM的细胞。由于细胞被氟硅石羧基化聚苯乙烯纳米球标记，因此它们也可以通过荧光显示(下部).

检测EZH2介导的侵袭在体内设置时，我们使用CAM分析。在该模型中，用荧光珠标记EZH2过表达的乳腺上皮细胞，将其一式两份接种在10天大的鸡胚的CAM上并孵育。在收获时，从CAM组织中制备冷冻切片，并在苏木精/伊红染色后通过荧光和光学显微镜进行检查。EZH2过度表达的乳腺上皮细胞持续促进CAM的侵袭（典型实验如图4d日).

讨论

在本研究中，我们描述了EZH2转录物和蛋白在多种乳腺疾病中的表达模式，并评估了EZH2作为乳腺癌患者预后标志物的实用性。与正常乳腺组织相比，浸润性癌和乳腺癌转移患者的EZH2在转录物和蛋白质水平上显著增加。形成血管内肿瘤栓子的细胞显著增加了EZH2的表达(图1c（c） 左侧)提示EZH2可能在血管浸润和乳腺癌转移中发挥作用。体外和体内EZH2在正常乳腺上皮细胞系中外源性过度表达的实验提供了生物学证据，证明EZH2可以介导凤尾鱼非依赖性生长和细胞膜侵袭，这是癌症的标志(36). 这一点特别有趣，因为靶向靶基因转录抑制的EZH2可能介导侵袭性癌症表型。

为了测试EZH2蛋白表达作为乳腺癌进展的预后生物标志物的临床实用性，我们评估了EZH2与治疗后生存率之间的关系。在单变量水平上，EZH2、肿瘤分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移和激素受体状态均与生存率显著相关。在多变量Cox回归分析中，高EZH2表达和淋巴结转移是预后的独立预测因素。单一最佳多变量模型包括高EZH2水平、阳性淋巴结和阴性PR状态。生物信息学van t Veer对乳腺癌cDNA表达谱的分析等。(30)结果表明，高EZH2水平与散发性浸润性癌患者5年内发生转移有关。这些发现支持将EZH2纳入临床列线图以帮助确定癌症进展风险的潜在临床实用性。

我们分析的一个主要局限性是其回顾性，这就排除了在激素或辅助治疗的情况下准确分析生存率。在我们的患者队列中，88%的ER阳性肿瘤接受了激素治疗。因此，考虑到肿瘤ER状态，我们严格评估了EZH2的预后意义。在激素依赖性和非依赖性乳腺癌患者中，EZH2与临床预后密切相关，表明其预后能力与ER状态无关。未来的研究将在验证队列中测试本研究中开发的模型，以确认这些初始观察结果。

EZH2作为侵袭性乳腺癌的生物标志物的预后意义可能与其生物学功能有关。EZH2是一组多梳蛋白的成员，参与维持可遗传基因表达谱，从而调节细胞类型鉴定。因此，细胞转录机制的失调可能会导致细胞类型身份的丧失和肿瘤转化。这里我们提供了EZH2失调促进致癌转化的生物学证据。乳腺上皮细胞中EZH2的过度表达诱导凤尾鱼非依赖性生长和细胞侵袭。EZH2过度表达细胞的侵袭性在两种细胞中都得到了证实在体外检测（即基底膜侵入室和SU-ECM检测）以及体内测定（即CAM）。EZH2过度表达诱导乳腺上皮细胞中HDAC酶活性。有趣的是，EZH2介导的细胞侵袭被HDAC抑制剂TSA和SAHA消除，这意味着EZH2-介导的侵袭需要HDAC活性。以前的报告表明，EZH2-EED PcG综合体招募了I型HDAC(18). 我们小组和其他小组已经发现EZH2介导的基因沉默需要完整的SET结构域和HDAC活性的补充(8)HDAC活性的抑制阻断了EZH2的转录抑制功能。包括SAHA在内的几种HDAC抑制剂已被证明在临床上有望用作抗肿瘤药物(37). 因此，我们认为HDAC抑制剂可能是EZH2过度表达肿瘤的有用治疗化合物。此外，EZH2诱导的HDAC活性可能解释了EZH2蛋白表达与ER阴性之间有趣的强相关性，人们可能推测EZH2-可能通过转录抑制ER。这方面的进一步研究可能是必要的。

最近的几项研究提供了强有力的证据，证明EZH2作为组蛋白H3甲基转移酶具有固有的活性，这可能代表了PcG沉默的机制(10,13–15). 曹等。(13)目前有证据表明EZH2的特异性靶标是组蛋白H3 N-末端尾部的赖氨酸27(13). 如果EZH2在乳腺癌进展中发挥作用，其固有的甲基转移酶活性可能成为一个有吸引力的治疗靶点。总之，这些研究表明细胞的转录记忆机制可能在癌症进展中起作用。

总之，我们发现EZH2是一种有希望的侵袭性乳腺癌的生物标记物，这不仅扩展了我们对前列腺癌的初步观察，而且还表明EZH2（以及细胞记忆机制）可能在激素调节组织的恶性肿瘤进展中起作用。临床上，我们的回顾性研究表明，EZH2水平可用于识别具有更具侵袭性表型的乳腺癌患者，从而提高我们的预后知识。虽然我们的结果很有希望，但EZH2的表达需要在仔细控制的临床试验中验证其与结果的关系。如果得到证实，应用EZH2免疫组织化学分析在技术上应该是简单可行的。除了EZH2的潜在预后效用外，我们还通过介导凤尾鱼非依赖性生长和细胞侵袭，为其与侵袭性癌症的关联提供了生物学机制。

补充材料

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：ER，雌激素受体；孕酮受体；PcG，Polycomb集团；组蛋白脱乙酰酶；TSA，曲古菌素A；ECM，胞外膜；SU，海胆；鸡胚绒毛尿囊膜；SAHA，辛烯酰苯胺异羟肟酸。

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